陶喬孝慈，馬 雪，張麗媛 ，操義恒 ，李 劼，周 霞，張星星，黃 新，吳桐忠*，韓猛立*，鐘發(fā)剛

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

牛呼吸道疾病(Bovine respiratory disease，BRD)是一種由多種因素引起的綜合征，包括環(huán)境和管理相關(guān)的應(yīng)激源以及多種病毒和細(xì)菌病原體，給北美和世界養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前仍然是影響北美地區(qū)肉牛最常見和損失最大的疾病，也是引起奶牛發(fā)病和死亡的重要原因[1]。我國(guó)目前尚未研制防控BRD的相關(guān)疫苗，防控措施較為單一，建議深入開展致病機(jī)理及防控技術(shù)研究，開發(fā)有效的診斷試劑與疫苗，對(duì)高效防控該類疾病，保障養(yǎng)牛業(yè)的健康、快速、可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[2-3]。Dubrovsky S A等[4]報(bào)道美國(guó)加州的飼養(yǎng)場(chǎng)中BRD的發(fā)病率約為75%和病死率接近50%；育肥場(chǎng)的發(fā)病率更高，初步估計(jì)發(fā)病率和病死率約為90%。而在奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中，斷奶犢牛BRD的發(fā)病率約為22%和病死率約20%，也是導(dǎo)致斷奶前犢牛死亡的主要原因。

BRD的發(fā)生是由多種因素引起并最終導(dǎo)致受感染牛表現(xiàn)臨床癥狀，但引起發(fā)病的細(xì)菌性病原體主要是溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)[5]。這些病原體已經(jīng)適應(yīng)并定植于呼吸道黏膜表面，從而逃避宿主的免疫反應(yīng)；適應(yīng)機(jī)制包括表達(dá)黏附素、產(chǎn)生和分泌毒素與蛋白酶以及形成生物膜。耐藥性是BRD病原菌中的一個(gè)新問題，而Mh廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)菌株的分離越來越普遍[6-7]。本文對(duì)引起B(yǎng)RD的兩種主要細(xì)菌性病原體的生物學(xué)特性、免疫逃避和致病機(jī)制、耐藥性與耐藥現(xiàn)狀及多重耐藥的遺傳機(jī)制，以及這些因素如何影響對(duì)此類疾病的診斷、治療和療效等進(jìn)行簡(jiǎn)要概述，以期為我國(guó)防控該病提供參考。

1 Mh與Pm概述

Mh和Pm是巴斯德菌科的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，通常定植于臨床健康牛的口咽部黏膜上。一般來說，這些微生物引起牛的臨床疾病是由應(yīng)激、免疫抑制和病毒感染的共同作用導(dǎo)致的，最終導(dǎo)致其在下呼吸道的過度生長(zhǎng)。越來越多的證據(jù)表明其具有傳染性，至少M(fèi)h可在種群內(nèi)傳播[8-9]。

多殺性巴氏桿菌由5種莢膜血清型(A、B、D、E、F)和16種菌體血清型(1-16)。相比之下，溶血性曼氏桿菌至少由12種莢膜血清型(1、2、5-9、12-14、16和17)組成。對(duì)于兩種病原體，莢膜血清型是引起宿主特異性和致病性的原因。盡管存在不同的血清型，但臨床疾病多集中在莢膜血清A1型Mh(>75%的病例)和莢膜血清A3型Pm(肉牛>30%和奶牛>60%的病例)。Cozens D等[10]的研究表明，A1型Mh的特異性毒力因子促進(jìn)了其在牛呼吸道上皮細(xì)胞的侵襲，使其能夠進(jìn)行不受控制的復(fù)制并擴(kuò)散到鄰近的細(xì)胞；一旦進(jìn)入細(xì)胞，能對(duì)受感染的組織造成廣泛的損害，同樣的現(xiàn)象沒有在呼吸道共棲的血清型中發(fā)現(xiàn)[10]。

除了莢膜型外，這兩種微生物都是革蘭氏陰性菌，其特征是細(xì)胞外壁存在脂多糖(LPS)。內(nèi)毒素是一種強(qiáng)有力的促炎介質(zhì)，可觸發(fā)細(xì)胞因子的釋放，并刺激炎癥細(xì)胞的涌入，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。此外，內(nèi)毒素與白細(xì)胞毒素協(xié)同作用可以增強(qiáng)Mh的致病性。

2 Mh與Pm的免疫逃避和致病機(jī)理

許多革蘭氏陰性病原體已經(jīng)進(jìn)化出在黏膜表面定植并增強(qiáng)細(xì)菌與宿主相互作用的機(jī)制。隨著時(shí)間的推移，對(duì)強(qiáng)毒株的詳細(xì)研究使得各種影響因素為人所知，這些因素使Mh和Pm在逃避宿主免疫反應(yīng)或增強(qiáng)臨床疾病方面沒有差異(表1)[5]。這種能力是很重要的，因?yàn)榱私庵虏〉牟煌玖σ蜃涌赡苡兄陂_發(fā)出以增強(qiáng)對(duì)這些化合物的免疫力為中心的控制策略。

表1 溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的免疫逃避機(jī)制和毒力因子

Mh和Pm都能產(chǎn)生一系列黏附素，這些黏附素允許上皮細(xì)胞附著并防止吞噬作用[5]。例如，莢膜 A型Pm的莢膜由透明質(zhì)酸組成，這種莢膜增強(qiáng)了與呼吸道上皮細(xì)胞的結(jié)合和在下呼吸道的定植。此外，Mh產(chǎn)生一種纖維蛋白原結(jié)合蛋白，該蛋白包裹在細(xì)菌細(xì)胞表面，阻止補(bǔ)體結(jié)合，從而降低調(diào)理作用[5]。值得注意的是，這些病原微生物的其他血清型的莢膜是由與宿主組織成分非常相似的物質(zhì)(如肝素、軟骨素)組成的，這可能導(dǎo)致它們的抗原性較差。

這些病原體還有其他幾種逃避和操縱宿主免疫系統(tǒng)的方法。例如，免疫球蛋白(Ig)A-特異性蛋白酶系列可以裂解IgA并阻止其與病原體結(jié)合[11]。這些蛋白酶的最終作用是防止調(diào)理作用或補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷。此外，Mh具有在呼吸道中形成生物膜的能力，生物膜是一種由多糖、蛋白質(zhì)和DNA組成的聚合物包裹的有組織的細(xì)菌群落，是細(xì)菌適應(yīng)生活在潛在的惡劣環(huán)境中的一種手段[11]。在健康的宿主中，大多數(shù)Mh可能存在于口咽和扁桃體隱窩的生物膜中。在生物膜內(nèi)，細(xì)菌可以免受抗菌藥物和宿主免疫反應(yīng)的影響。當(dāng)病原微生物處于生物膜而非浮游狀態(tài)時(shí)，許多抗菌藥物對(duì)Mh的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)倍增[12]。此外，研究表明，宿主產(chǎn)生的應(yīng)激性化學(xué)物質(zhì)(P物質(zhì)、去甲腎上腺素、腎上腺素)可以促進(jìn)生物膜擴(kuò)散，生物膜是一種能夠從上呼吸道向下呼吸道運(yùn)動(dòng)的因子，并將應(yīng)激與臨床BRD聯(lián)系起來[13]。

白細(xì)胞毒素是一種由Mh產(chǎn)生的與臨床疾病相關(guān)的重要毒力因子，這種毒素的重要性與Mh致病性直接相關(guān)。因此，在設(shè)計(jì)Mh的控制方案時(shí)，必須首先考慮白細(xì)胞毒素的影響。白細(xì)胞毒素是毒素(repeat in toxin，RTX)家族中的重復(fù)序列，在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所有Mh均可產(chǎn)生[6]。白細(xì)胞毒素可特異性地與牛中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞表面的分化簇(cluster of differentiation，CD)18相互作用，一旦與之接觸，中性粒細(xì)胞就會(huì)脫顆粒并釋放有效的消化酶進(jìn)入周圍組織。此外，白細(xì)胞毒素刺激組織肥大細(xì)胞的脫顆粒和血管活性介質(zhì)的釋放。如前所述，內(nèi)毒素和白細(xì)胞毒素具有協(xié)同作用，內(nèi)毒素是一種有效的趨化劑，可使中性粒細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞進(jìn)入呼吸道。此外，內(nèi)毒素的釋放有助于CD18在炎性細(xì)胞表面的上調(diào)表達(dá)。因此，更多的細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞毒素具有更高親和力，其存在可導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床疾病發(fā)生[5]，如Mh經(jīng)常與典型的纖維蛋白性胸膜肺炎的發(fā)生相關(guān)。

3 Mh與Pm的耐藥性

獸醫(yī)最關(guān)心的是細(xì)菌的臨床抗藥性，他們感興趣的是某種特定抗菌藥物能有效治療被某種特定病原體感染而導(dǎo)致某種疾病的動(dòng)物[14]。臨床耐藥的概念是基于臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)——獸醫(yī)抗菌藥物敏感性測(cè)試委員會(huì)制定的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)，具體如下：一是特定細(xì)菌病原體代表性群體的抗菌藥物的體外最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)范圍；二是通過藥物濃度與微生物敏感性之間的關(guān)系，建立的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)的參數(shù)；三是在目標(biāo)物種中進(jìn)行臨床試驗(yàn)的結(jié)果[15]。

對(duì)于BRD病原體，CLSI批準(zhǔn)了針對(duì)青霉素(僅限于肉湯稀釋法)、頭孢噻呋、達(dá)氟沙星(danofloxacin)、恩諾沙星、氟苯尼考、硫酸大觀霉素、拖拉霉素(tulathromycin)、加米霉素(gamithromycin)、泰地羅新(tildipirosin)和替米考星(tilmicosin)的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)[16]；對(duì)于這些抗菌藥物，敏感性結(jié)果表明治療成功的可能性明顯大于耐藥性結(jié)果。這些藥敏結(jié)果僅適用于按照抗菌藥物使用說明進(jìn)行，且藥敏試驗(yàn)采用CLSI批準(zhǔn)的方法和解釋標(biāo)準(zhǔn)的情況下，然而藥敏試驗(yàn)與臨床結(jié)果之間的關(guān)系并不完善。同樣有一點(diǎn)非常重要，我們必須認(rèn)識(shí)到抗菌藥物藥敏試驗(yàn)不能保證在單個(gè)動(dòng)物身上得到特定的臨床結(jié)果。試圖通過體外測(cè)試獲得的藥敏結(jié)果來推斷體內(nèi)反應(yīng)，疾病結(jié)果通常受到諸如宿主免疫狀態(tài)、個(gè)體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化或疾病嚴(yán)重程度增加/病程延長(zhǎng)等因素的影響。對(duì)于沒有CLSI批準(zhǔn)的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)的抗菌藥物，已從其他物種的血漿和組織液中推斷獲得，例如青霉素G(紙片擴(kuò)散法)、四環(huán)素(紙片擴(kuò)散法)、強(qiáng)化磺胺類藥物、氨基糖苷類藥物和紅霉素等藥物[17]。對(duì)于這些抗菌藥物而言敏感結(jié)果優(yōu)于耐藥性結(jié)果，但是目前尚無相關(guān)數(shù)據(jù)可將敏感性測(cè)試結(jié)果與牛BRD的預(yù)期結(jié)果相關(guān)聯(lián)。

第二種耐藥性是根據(jù)監(jiān)測(cè)細(xì)菌野生型種群中藥物敏感性分布特征變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行定義的[18]。這些流行病學(xué)臨界值沒有提供與臨床結(jié)果相關(guān)的數(shù)據(jù)，而是代表了MIC與原始細(xì)菌種群的偏差，可以用來指示耐藥性決定因素的出現(xiàn)。因此，流行病學(xué)臨界值可能表明MIC的耐藥性與臨床藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)有所不同(通常更低)。此外，盡管文中提到的許多研究可能涉及多種抗菌藥物，但僅討論CLSI已建立敏感性結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)的藥物；病原體為Mh、Pm和睡眠嗜血桿菌(Histopilussomni，Hs)，抗菌藥物為頭孢噻呋、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、加米霉素、青霉素、大觀霉素、四環(huán)素、泰地羅新、拖拉菌素、替米考星(僅適用于Mh)。

4 Mh與Pm的流行率與耐藥模式

最早建立的Mh與Pm的MIC分布是利用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室診斷方法和CLSI批準(zhǔn)的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)1988年至1992年期間死于BRD的動(dòng)物調(diào)查得出的[19]；在這項(xiàng)研究中，對(duì)美國(guó)和加拿大20多個(gè)州的461株Mh和318株P(guān)m菌株進(jìn)行MIC測(cè)定，結(jié)果表明Mh和Pm分離菌株100%對(duì)頭孢噻呋敏感，83.5%和83.3%對(duì)大觀霉素敏感，57% 和70.5%對(duì)四環(huán)素敏感，69.1%和未測(cè)試對(duì)替米考星敏感。值得注意的是，研究中使用的替米考星的解釋標(biāo)準(zhǔn)在Mh與Pm上均未通過驗(yàn)證；按照目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，使用該藥物的耐藥性將顯著降低(>90%敏感)。對(duì)1994年至2002年俄克拉荷馬州死于BRD的肉牛肺中分離獲得的390株Mh和292株P(guān)m耐藥性進(jìn)行研究，結(jié)果表明四環(huán)素和大觀霉素的敏感性各不相同且較低，氟苯尼考和替米考星與頭孢噻呋和恩諾沙星的結(jié)果正好相反，敏感性很高且相對(duì)穩(wěn)定[20]。對(duì)2000年至2009年間美國(guó)和加拿大收集的Mh(n=2 977)和Pm(n=3 291)分離株進(jìn)行藥物敏感性評(píng)估，結(jié)果顯示頭孢噻呋對(duì)兩種病原體均保持高度敏感且一致(100%敏感)，對(duì)達(dá)氟沙星、恩諾沙星和氟苯尼考的敏感性隨時(shí)間的推移保持穩(wěn)定，而對(duì)替米考星和拖拉菌素的敏感性均下降[21]。一項(xiàng)來自堪薩斯州立大學(xué)的對(duì)細(xì)菌多重耐藥性和共同耐藥模式的研究，被認(rèn)為具有里程碑意義，該研究評(píng)估了2009年至2011年期間從患有BRD的牛肺部分離的Mh分離菌株；研究結(jié)果表明分離株對(duì)5種或5種以上抗菌藥物的耐藥性比例從5%增加到35%，對(duì)土霉素或替米考星耐藥的菌株，至少對(duì)另外1種抗菌藥物的耐藥性明顯更高[22]。

研究人員對(duì)到達(dá)和離開育肥場(chǎng)的牛就抗菌藥物的耐藥性進(jìn)行了多項(xiàng)研究。Klima C L等[23]對(duì)阿爾伯塔省南部2個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)，在進(jìn)入時(shí)和離開前30 d內(nèi)選取30%圈舍采集10%的動(dòng)物鼻拭子樣本，用于Mh的分離和藥敏試驗(yàn)，獲得了409株Mh，藥敏結(jié)果顯示對(duì)所有抗菌藥物的耐藥性從0.2%到3.9%不等且都很低，其中對(duì)土霉素普遍耐藥；值得注意的是，該研究中許多被評(píng)估的抗菌藥物，CLSI沒有明確由Mh引起的BRD的藥敏結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)，這使得研究中的一些結(jié)論難以解釋。Noyes N R等[16]對(duì)加拿大4個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)按照到達(dá)時(shí)和離開前的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采集深部鼻咽(deep nasopharyngeal，DNP)拭子，獲得2 989株Mh，評(píng)估21種不同抗菌藥物的敏感性，耐藥性很少見，87%的菌株對(duì)所有抗菌藥物都敏感。值得注意的是該研究與Klima的相似，許多被評(píng)估的抗菌藥物， CLSI沒有解釋標(biāo)準(zhǔn)。一項(xiàng)來自加拿大的研究評(píng)估了從健康和患有BRD的牛身上分離出Mh的耐藥模式， 18%的分離菌株具有耐藥性[17]。總的來說，收集于BRD牛的分離株(32%)比健康牛 (2%)更容易產(chǎn)生耐藥性。分離菌株普遍對(duì)四環(huán)素耐藥，一般來說，如果分離株對(duì)一種藥物耐藥，它也至少對(duì)一種其他的抗菌藥物耐藥[17]。

Snyder E等[7]評(píng)估了使用長(zhǎng)效大環(huán)內(nèi)酯類藥物拖拉霉素預(yù)防Mh耐藥性的流行情況，取得了令人驚訝的結(jié)果。犢牛在進(jìn)入育肥場(chǎng)之前被給予拖拉霉素以防止BRD發(fā)生，在抵達(dá)當(dāng)天采集DNP拭子，10 d～14 d后再采集1次。結(jié)果表明與在抵達(dá)時(shí)相比，對(duì)于除頭孢噻呋外的所有抗菌藥物，第二次被劃分為中介或耐藥的分離株比例顯著增加。第二次藥敏結(jié)果顯示0.8%表現(xiàn)為敏感， 24.4%對(duì)2種抗菌藥物(氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類)中介或耐藥， 74.8%對(duì)3種抗菌藥物(氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類以及酚類或頭孢菌素類)表現(xiàn)為中介或耐藥[7]。評(píng)估恩諾沙星和拖拉菌素在治療和預(yù)防犢牛BRD中的療效和耐藥性時(shí)得出了與Snyder類似的結(jié)果。Woolums A R等[18]進(jìn)行的相關(guān)研究也得出了類似的結(jié)果，使用大劑量泰地羅新進(jìn)行藥物治療后采集DNP拭子，分離鑒定的Mh分離株幾乎對(duì)除頭孢噻呋外的所有藥物均具有耐藥性，且100%屬于多重耐藥(multidrug resistance，MDR)。

綜上所述，許多有關(guān)BRD主要細(xì)菌性病原體耐藥性的研究工作都來自飼養(yǎng)場(chǎng)和育肥場(chǎng)。而在養(yǎng)殖場(chǎng)中，關(guān)于耐藥性的研究相對(duì)較少。來自瑞士的Pipoz F等[19]收集了來自52個(gè)奶牛群的中犢牛臨床樣本，對(duì)樣本中Mh和Pm分離菌株的耐藥流行情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明Mh(n=8)分離菌株對(duì)四環(huán)素、恩諾沙星、青霉素、頭孢噻呋、大觀霉素和氟苯尼考敏感；相比之下，Pm(n=37)分離菌株對(duì)恩諾沙星、頭孢噻呋、大觀霉素和氟苯尼考敏感，但對(duì)替米考星呈現(xiàn)中介，對(duì)四環(huán)素呈現(xiàn)耐藥。Owen J R等[20]評(píng)估了美國(guó)加利福尼亞的一個(gè)育肥場(chǎng)和飼養(yǎng)場(chǎng)采集的犢牛鼻拭子中分離出的Mh和Pm菌株耐藥性的流行情況，結(jié)果顯示Mh和Pm分離株對(duì)頭孢噻呋和恩諾沙星敏感，其中大多數(shù)Pm分離株對(duì)青霉素和托拉菌素敏感，超過50%對(duì)達(dá)氟沙星耐藥，30%對(duì)氟苯尼考耐藥，90%以上的對(duì)四環(huán)素和替米考星耐藥；所有的Mh分離株均對(duì)大觀霉素敏感，20%對(duì)達(dá)氟沙星、拖拉菌素和氟苯尼考耐藥，30%對(duì)替米考星耐藥，有60%對(duì)青霉素耐藥。一項(xiàng)來自Snyder E等[5]的最新研究，收集了加利福尼亞一個(gè)牧場(chǎng)的100頭診斷為BRD的奶牛樣本(經(jīng)鼻腔清洗、支氣管肺泡灌洗液的DNP拭子)，對(duì)樣本中分離的Mh(n=53)和Pm(n=175) 進(jìn)行了藥物敏感性評(píng)估，結(jié)果顯示多數(shù)Pm(>90%)分離菌株對(duì)氨芐西林、頭孢噻呋、青霉素、大觀霉素和托拉菌素敏感，但對(duì)恩諾沙星和氟苯尼考耐藥；相比之下，大多數(shù)Mh (>90%)對(duì)氨芐西林、頭孢噻呋、青霉素和氟苯尼考敏感，對(duì)恩諾沙星和大觀霉素中介，對(duì)拖拉菌素耐藥。

5 多重耐藥的遺傳機(jī)制

上述表明BRD是主要細(xì)菌性病原體，特別是Mh的耐藥性正在增加，廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)Mh的分離也越來越普通。所以，問題是只接觸一種藥物后，如何產(chǎn)生對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性？通常是水平基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了抗藥性的迅速增加。水平基因轉(zhuǎn)移有3種不同的方式：(1)通過轉(zhuǎn)化從環(huán)境中所謂的外源DNA中獲取基因；(2)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)由噬菌體轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)；(3)通過獲取可移動(dòng)的遺傳元素[21-22]。雖然這3種機(jī)制都可以在獲得耐藥性中發(fā)揮作用，但在Mh和Pm中，多重耐藥(multidrug resistance，MDR)菌株增加的主要驅(qū)動(dòng)因素似乎是獲得一種稱為整合共軛因子(integrative conjugative element，ICE)的移動(dòng)遺傳元件[23]。ICE是整合到宿主染色體中的移動(dòng)遺傳元件，然后可以將它們繁殖并傳給后代，但也可以自我切割，以環(huán)狀中間體的形式復(fù)制，并通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到其他鄰近細(xì)胞，最終整合到新宿主的染色體中[22]。ICE中通常還帶有其他載體基因包括抗藥性基因，受體細(xì)胞正是隨著ICE轉(zhuǎn)移的這種方式迅速獲得了多種抗藥性基因[24]。

Mh和其他與BRD相關(guān)的巴氏桿菌科中已記錄了大量不同的ICEs。Pm(ICE-Pmu1)中鑒定出第一個(gè)攜帶四環(huán)素、氟苯尼考、磺酰胺、大觀霉素、恩諾沙星、替米考星和拖拉霉素抗性的ICE基因。 Eidam C等[25]在Mh 菌株42548中發(fā)現(xiàn)鑒定出第一個(gè)ICE基因是ICEMh1，該ICE基因比ICEPmu1長(zhǎng)但缺少一些基因，這些基因賦予了ICEPmu1對(duì)相同數(shù)量的抗藥性基因。

2014年Klima C L等[23]對(duì)來自Mh、Pm和Hs的25個(gè)ICEs進(jìn)行了鑒定。在采集自喬治亞州肉牛育肥場(chǎng)的Mh分離菌株中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)ICEs(命名為UGA1，UGA2，UGA3)，這些ICEs的長(zhǎng)度各不相同，但與ICEMh1和ICEPmu1具有同源性；ICEMh-UGA1和ICEMhUGA2的前1/4與ICEMh1相似，而其余3/4與ICEPmu1相似。此外，這些ICEs攜帶的所有抗性基因與存在于ICEPmu1中的相同，但I(xiàn)CEMh-UGA2中不含有floR基因(對(duì)氯霉素類藥物具有抗性的基因)；與鑒定出的其他兩種ICE不同，ICEMh-UGA3僅攜帶tetH/R抗性基因復(fù)合體(該復(fù)合體編碼對(duì)四環(huán)素類抗生素的抗性基因)。

ICEs中存在的耐藥基因?qū)?duì)多種類型、具有抗菌作用的大量抗菌藥物產(chǎn)生抗性。在Mh分離株攜帶的β-內(nèi)酰胺抗性基因中，最常見的是blaOXA-2，其次是blaROB-1(盡管該基因攜帶在不依賴于ICE的質(zhì)粒上的可能性較大，就像最近發(fā)現(xiàn)的blaROB-2基因)[8,23,26-27]。所有這些編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因，不僅對(duì)經(jīng)典的青霉素類藥物，而且對(duì)較新的廣譜頭孢菌素類藥物都具有抗性[27]。已知所有這些基因均可傳遞對(duì)氨芐青霉素和青霉素的耐藥性，并可能增加頭孢噻呋的MIC[23,28]。不過，這些基因的存在可能不會(huì)自動(dòng)導(dǎo)致抗性，因?yàn)橐阎@些基因會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)致基因失活的點(diǎn)突變[29]。

Mh和Pm對(duì)氯霉素類抗生素的耐藥性通常是由floR基因的存在引起的[23]。該基因編碼一種藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能主動(dòng)地將氯霉素類抗生素泵出細(xì)胞。然而在某些情況下，floR并不能使Mh和Pm產(chǎn)生完全的抗性而是將MIC調(diào)整到中間范圍，這可能是因?yàn)檫@些微生物中基因的活性降低。tet類基因是編碼四環(huán)素的最常見抗性基因，這些基因可調(diào)控外排泵將四環(huán)素主動(dòng)泵出細(xì)菌細(xì)胞。在Mh和Pm中，tetH、tetB、tetL和tetG是編碼這種泵的最常見基因，它們可以在質(zhì)粒和細(xì)菌染色體中找到[30]。但是在Mh和Pm的ICEs中僅發(fā)現(xiàn)并記錄了tetH基因[23,25]。在這些ICEs中通常還存在一個(gè)tetR基因(有時(shí)是重復(fù)的)，它充當(dāng)tet基因?qū)λ沫h(huán)素濃度敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[23,25,31]。

大環(huán)內(nèi)酯類藥物廣泛應(yīng)用處于高風(fēng)險(xiǎn)的BRD牛身上[32]。erm42、msrE和mphE基因是Mh和Pm ICE中最常見的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因，它們以不同的方式對(duì)這類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明erm42基因編碼一個(gè)單甲基轉(zhuǎn)移酶，該轉(zhuǎn)移酶在23S核糖體亞基上的A2058核苷酸處添加了一個(gè)甲基基團(tuán)，從而導(dǎo)致對(duì)林可酰胺類藥物的耐藥性，以及對(duì)低濃度大環(huán)內(nèi)酯類和鏈霉素類抗生素具有耐藥性。msrE基因編碼大環(huán)內(nèi)酯類外排泵，對(duì)14元和15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物如紅霉素、拖拉菌素和加米霉素產(chǎn)生耐藥性；然而，它不產(chǎn)生對(duì)16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性，如泰樂菌素、替米考星和泰地羅新。mphE基因是一種大環(huán)內(nèi)酯類磷酸轉(zhuǎn)移酶，在傳遞抗菌藥物耐藥性的方面與msrE具有相似的作用機(jī)制。隨著時(shí)間的推移，磺胺類藥物在治療牛病上的療效逐漸下降，伴隨著新抗菌藥物的出現(xiàn)其使用量越來越少。sul1和sul2基因是革蘭氏陰性菌對(duì)磺胺類藥物的主要耐藥基因，它們是通過編碼一種耐藥的二氫葉酸合成酶來起作用的。到目前為止，在Mh和Pm中僅發(fā)現(xiàn)sul2基因和ICE相關(guān)。ICE中存在的其他基因有aadA25、aadB、strA和strB以及aphA1，這些基因編碼對(duì)氨基糖苷類抗生素的抗性。aadA25(ant3〃)通過編碼氨基糖苷類O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)對(duì)氨基糖苷大觀霉素和氨基糖苷鏈霉素的耐藥性。aadB(ant2〃)也編碼氨基糖苷O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶，但對(duì)慶大霉素、妥布霉素、地貝卡星(Dibekacin)、西索米星(Sisomicin)和卡那霉素產(chǎn)生耐藥性。strA(aph3〃)、strB(aph6)和aphA1(aph3′)是抗性基因，其編碼修飾和使氨基糖苷失活的氨基糖苷O-磷酸轉(zhuǎn)移酶。strA和strB均對(duì)鏈霉素產(chǎn)生耐藥性，而aphA1則對(duì)卡那霉素、新霉素、巴龍霉素(paromomycin)、核糖霉素和利維霉素(lividomycin)產(chǎn)生耐藥性。

導(dǎo)致Mh分離菌株XDR株流行率上升的因素可能是攜帶多種基因，這些基因?qū)δ壳坝糜陬A(yù)防和治療BRD的大多數(shù)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。重要的是由于牛呼吸道病原體具有XDR的性質(zhì)，接觸一種抗菌藥物不再僅僅是選擇對(duì)這一種抗菌藥物的耐藥性。耐藥性現(xiàn)在是一種多藥現(xiàn)象，接觸一種抗菌藥物中會(huì)選擇對(duì)其他多種相關(guān)和不相關(guān)的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。關(guān)于BRD病原體耐藥性的另一個(gè)重要因素，就是耐藥性的增加很大程度上是由眾多MhXDR菌株所攜帶的ICE導(dǎo)致的[8]?？咕幬飳?dǎo)致XDR菌株的擴(kuò)增和繁殖，以及隨后該菌株基因組中攜帶的所有基因和突變。因此，如果動(dòng)物被診斷出患有BRD并接受了一種特定的抗菌藥物治療，那么該動(dòng)物隨后不僅會(huì)攜帶對(duì)該抗菌藥物具有耐藥性的分離株，而且會(huì)對(duì)該動(dòng)物分離株ICE所攜帶的其他所有抗菌藥物具有抗性，因?yàn)椴煌幕蛑g存在聯(lián)系[7,9]。此外，由于XDR Mh菌株也含有對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的突變，盡管該基因/突變未攜帶在ICE上，但對(duì)此類抗菌藥物的仍將呈現(xiàn)耐藥表型[8,18]。重要的是，有新的證據(jù)表明這些菌株可能通過牛犢之間的接觸以及暴露于受污染的環(huán)境，在具有感染風(fēng)險(xiǎn)的牛群中傳播[8-9,16]。因此，了解XDR，重要的是不要僅僅局限于治療過的動(dòng)物；相反，有可能會(huì)在與治療動(dòng)物使用但從未接觸過抗菌藥物的動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)XDR克隆[16]。

6 抗菌藥物耐藥性對(duì)治療結(jié)果的影響

首次治療成功的定義是在第一次應(yīng)用抗菌藥物治療效果顯著的動(dòng)物比例。在大多數(shù)育肥牛飼養(yǎng)場(chǎng)中首次治療成功的比例都很高。通常，大于80%的首次治療成功比例被認(rèn)為是可以接受的。但是，Avra T D等[33]對(duì)引起治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行評(píng)估和回顧性研究發(fā)現(xiàn)，超過30%的牛對(duì)首次治療沒有反應(yīng)，而且暴露于高風(fēng)險(xiǎn)感染狀態(tài)比低風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)的犢牛首次治療失敗的可能性大。但是關(guān)于耐藥性對(duì)患BRD牛臨床預(yù)后的影響很少有人評(píng)估，Mcclary研究表明處于易受Mh分離株感染中的牛群 62%(n=688)對(duì)替米考星治療有反應(yīng)，但是38%(n=6)的牛攜帶耐藥菌株。

7 結(jié)語

在臨床治療中必須認(rèn)識(shí)到毒力因子和抗菌藥物耐藥性，并在制定以這些病原微生物為中心的治療和控制方案時(shí)考慮這些因素。盡管BRD對(duì)北美乃至世界養(yǎng)牛業(yè)具有重要意義，養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家包括我國(guó)在內(nèi)的研究人員很少有經(jīng)過精心設(shè)計(jì)的研究來評(píng)估引起B(yǎng)RD重要細(xì)菌性病原體的抗藥性?，F(xiàn)在發(fā)表的多數(shù)文獻(xiàn)均是來自于經(jīng)過多次不同抗菌藥物治療的病死牛樣本中獲得實(shí)驗(yàn)診斷報(bào)告，且這些動(dòng)物已經(jīng)用多種不同的抗菌藥物進(jìn)行了多次治療。以Mh為例，總體趨勢(shì)表明，隨著時(shí)間的推移敏感性降低了，臨床耐藥菌株在逐漸增加。近年的研究表明，某些牛場(chǎng)中常見的抗菌藥物使用方法可能是促使耐藥克隆增加的主要因素。在科研人員做好流行病學(xué)、病原分離鑒定、致病機(jī)理、耐藥性與免疫防控研究的基礎(chǔ)上，廣大從事具體養(yǎng)殖的牧場(chǎng)主和從業(yè)人員，應(yīng)將重點(diǎn)放在養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全防控、減少應(yīng)激、增強(qiáng)免疫功能和抗菌藥物管理上，將有助于成功控制由這些微生物引起的疾病綜合征，減少由此產(chǎn)生的負(fù)面影響和經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)養(yǎng)殖健康可持續(xù)發(fā)展。