吳海燕，馮文紅，吳文欣，許洋溢，楊雨晴，刁迎珠，張志強(qiáng)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

爬行動(dòng)物的免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物相似，也包含天然免疫、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和體液免疫三部分[1]。然而，因缺少模式動(dòng)物和適用于監(jiān)測(cè)爬行動(dòng)物健康狀態(tài)的免疫指標(biāo)，與哺乳動(dòng)物相比，爬行動(dòng)物免疫生態(tài)學(xué)(Immunological ecology)研究起步較晚，進(jìn)展較慢[1]。溫度是爬行動(dòng)物經(jīng)常面臨的環(huán)境脅迫因子之一，能影響免疫系統(tǒng)的不同部分[2-4]。其中，白細(xì)胞的類型和數(shù)量隨季節(jié)[5-6]、日齡[7-8]等因素而變化，中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值通常被認(rèn)為與應(yīng)激反應(yīng)能力有關(guān)[9]；血漿(或血清)殺菌能力可代表脊椎動(dòng)物的天然免疫能力[1]。無論是血液中的各型白細(xì)胞占比情況，還是血漿(或血清)殺菌能力測(cè)定，都具有需血量少的特點(diǎn)，前者約需20 μL全血，后者約需10 μL血漿或血清[10]。因此，若能在不影響動(dòng)物存活的情況下活體采集血液，必將促進(jìn)爬行動(dòng)物免疫生態(tài)學(xué)研究向縱深發(fā)展。

紅耳滑龜(Trachemysscriptaelegans)是世界上危害最嚴(yán)重的入侵物種之一，已擴(kuò)散至我國大部分地區(qū)，有野生種群存在[11]。對(duì)紅耳滑龜及其多個(gè)亞種免疫功能的季節(jié)動(dòng)態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞介導(dǎo)的免疫能力、體液免疫能力和天然免疫能力變化趨勢(shì)不同[5-6,12]，其稚龜對(duì)植物血凝素的反應(yīng)快于中華草龜(Chinemysreevesii)且數(shù)值較高[13]。本研究設(shè)置了20、24、28、32 ℃ 4個(gè)溫度梯度組，采用活體背甲下靜脈竇采血技術(shù)，比較了經(jīng)6周溫度馴化處理后，紅耳滑龜在較適宜的溫度范圍內(nèi)血液中各型白細(xì)胞的百分比和血漿殺菌能力的變化，旨在確定免疫系統(tǒng)不同組分響應(yīng)溫度波動(dòng)的策略，為控制其擴(kuò)散提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 快速瑞氏-吉姆薩染液(D010)，南京建成生物工程有限公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)凍干粉(ATCC#8739)，廣東省微生物菌種保藏中心產(chǎn)品；含L-谷氨酸鹽的非CO2依賴的培養(yǎng)基(Invitrogen,Gibco media #18045)，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；碘酊、肝素鈉、胰蛋白酶大豆瓊脂糖和無菌1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 大塑料箱(規(guī)格為長(zhǎng)×寬×高=60 cm×36 cm×36 cm)、加熱棒，某網(wǎng)店產(chǎn)品；JA2003N電子天平，上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；BA-210生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；BXM-30R立式壓力蒸氣滅菌器，上海東亞壓力容器制造有限公司產(chǎn)品；TG-16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀集團(tuán)產(chǎn)品；PWT-P-B電熱恒溫培養(yǎng)箱，合肥達(dá)斯卡特科學(xué)器材有限公司產(chǎn)品；BCD-539WT海爾冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；TL-2000A智能血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)器，江蘇姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；移液器、載玻片、蓋玻片、中性樹膠、直尺、1.5 mL離心管、1 mL一次性無菌注射器、脫脂棉、不銹鋼涂布棒和一次性培養(yǎng)皿等，江蘇省海門市創(chuàng)慧實(shí)驗(yàn)器材廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)用動(dòng)物飼養(yǎng)和分組 從合肥市裕豐花市花鳥魚蟲市場(chǎng)購買48只紅耳滑龜，初始體重為81.1g±2.3 g,(52.8 g～119.9 g)。初始水溫維持為20 ℃±1 ℃、水深約10 cm，隨機(jī)分入4個(gè)大塑料箱飼養(yǎng)，每箱12只，箱底鋪石塊，形成部分陸地環(huán)境。以網(wǎng)購龜糧飼喂，每隔2 d換水1次，水為曝氣24 h以上的自來水。

室內(nèi)暫養(yǎng)15 d 后，測(cè)量體重、背甲長(zhǎng)和背甲寬后，空調(diào)控制室溫為23 ℃±1 ℃，加熱棒維持大塑料箱水溫至20 ℃±1 ℃、24 ℃±1 ℃、28 ℃±1 ℃和32 ℃±1 ℃，分別簡(jiǎn)稱為20 ℃組、24 ℃組、28 ℃組和32 ℃組，自然光照。飼養(yǎng)6周后，再次測(cè)定體重、背甲長(zhǎng)和背甲寬，通過1 mL無菌注射器在3 min內(nèi)活體從紅耳滑龜背甲下靜脈竇處采集血液約0.3 mL，用預(yù)先經(jīng)肝素鈉處理過的1.5 mL離心管暫存血液，脫脂棉蘸碘酊消毒采血部位。

1.2.2 血涂片制作和各型白細(xì)胞百分比的測(cè)定 用移液器迅速從離心管中取20 μL血液，每只龜制作血涂片2張。參照劉溯源等[8]的描述，37 ℃烘片48 h后，按試劑盒說明書，用快速瑞氏-吉姆薩染液染色血涂片。血涂片中各型白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)的百分比的計(jì)算公式為：任一類型的白細(xì)胞百分比(%)= (1張血涂片中100個(gè)白細(xì)胞中某一類型的白細(xì)胞總數(shù)+另外1張血涂片中100個(gè)白細(xì)胞中同一類型的白細(xì)胞總數(shù))/2。中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值(ratio of neutrophils to lymphocytes，ratio of N/L，RU)= 中性粒細(xì)胞的百分比(%)/淋巴細(xì)胞的百分比(%)。

1.2.3 血漿殺菌能力測(cè)定 參照張志強(qiáng)等[7]對(duì)滑鼠蛇(Ptyasmucosus)的血清殺菌能力測(cè)定方法進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下：用1 mol/L PBS將大腸埃希氏菌凍干粉制成細(xì)菌液，37 ℃水浴激活后倍比稀釋，制成細(xì)菌工作液；取制作血涂片后的剩余血液，在6 000 r/min離心10 min后取上清液，置-20 ℃凍存，室溫融化血漿后，取10 μL與含有2.34 mg/L-谷氨酸鹽的非CO2依賴的培養(yǎng)基200 μL混勻，之后加入20 μL細(xì)菌工作液，充分混勻后37 ℃水浴30 min，取胰蛋白酶大豆瓊脂糖平板，每個(gè)平板加入50 μL孵育后的樣品，均勻涂布做2個(gè)重復(fù)。以不加血漿樣品、只加液體培養(yǎng)基的平板作為對(duì)照平板，重復(fù)3次。倒置平板，37 ℃孵育24 h后，計(jì)數(shù)每一平板的菌落數(shù)，陰性對(duì)照組的菌落范圍數(shù)為52～234個(gè)/平板。血漿殺菌能力(%)=[1﹣(每一樣品的菌落數(shù)/陰性對(duì)照組的平均菌落數(shù))]×100。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS軟件包(SPSS 19.0 for windows)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用One sample Kologorov-Smirnov test檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況，對(duì)不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換：初背甲寬、N/L的比值進(jìn)行常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，單核細(xì)胞的百分比、血漿殺菌能力進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換；單核細(xì)胞的百分比經(jīng)轉(zhuǎn)換后仍不符合正態(tài)分布，故用非參數(shù)檢驗(yàn)中的多個(gè)獨(dú)立樣本的Kruskal-Wallis H法比較不同溫度組的組間差異。用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較不同溫度組試驗(yàn)開始時(shí)和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重、背甲長(zhǎng)和背甲寬的組間差異，以及不同溫度組試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各型白細(xì)胞的百分比(單核細(xì)胞的百分比除外)、N/L的比值和血漿殺菌能力的組間差異。文中數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)紅耳滑龜體重、背甲長(zhǎng)和背甲寬的影響

結(jié)果見表1。紅耳滑龜試驗(yàn)開始時(shí)20 ℃組、24 ℃組、28 ℃組和32 ℃組的初體重(F3,44=0.518,P>0.05)、初背甲長(zhǎng)(F3,44=0.554,P>0.05)和初背甲寬(F3,44=1.009,P>0.05)，以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的終體重(F3,44=0.593,P>0.05)、終背甲長(zhǎng)(F3,44=0.818,P>0.05)和終背甲寬(F3,44=0.200,P>0.05)均無顯著的組間差異。

表1 不同溫度組紅耳滑龜體重、背甲長(zhǎng)和背甲寬的變化

2.2 溫度對(duì)紅耳滑龜各型白細(xì)胞的百分比、N/L的比值和血漿殺菌能力的影響

結(jié)果見表2。淋巴細(xì)胞的百分比24 ℃組顯著高于20 ℃組(F3,44=3.777,P<0.05)，嗜堿性粒細(xì)胞的百分比24 ℃組顯著低于28 ℃組和20 ℃組(F3,44=5.019,P<0.05)。中性粒細(xì)胞的百分比20 ℃組和32 ℃組較高，24 ℃組和28 ℃組較低，但未見明顯的組間差異(F3,44=0.748,P>0.05)；嗜酸性粒細(xì)胞的百分比20 ℃組和32 ℃組較高，28 ℃組其次，24 ℃組最低，也無明顯的組間差異(F3,44=1.745,P>0.05)；單核細(xì)胞的百分比24 ℃組最高，其他溫度組較低，但無明顯的組間差異(F3,44=1.952,P>0.05)。N/L的比值變幅較大，20 ℃組和32 ℃組較高，24 ℃組和28 ℃組較低，但未見明顯的組間差異(F3,44=0.671,P>0.05)。20 ℃組、24 ℃組、28 ℃組和32 ℃組的血漿殺菌能力24 ℃組和28 ℃組較高，20 ℃組和32 ℃組較低，但均無明顯的組間差異(F3,44=2.752,P>0.05)。

表2 紅耳滑龜不同溫度組各型白細(xì)胞的百分比、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值和血漿殺菌能力的變化

3 討論

爬行動(dòng)物血液中的血細(xì)胞是免疫防御的重要有形成分，各型白細(xì)胞的百分比與體液免疫、細(xì)胞免疫和天然免疫等多種組分有關(guān)，可執(zhí)行不同的功能[7-9]。紅耳滑龜血液中淋巴細(xì)胞的百分比24 ℃組高于20 ℃組，而嗜堿性粒細(xì)胞的百分比28 ℃和20 ℃組都高于24 ℃組，淋巴細(xì)胞可分為T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞三類，T細(xì)胞受抗原刺激激活后，參與細(xì)胞免疫，B細(xì)胞激活后與體液免疫有關(guān)，而嗜堿性粒細(xì)胞則與天然免疫有關(guān)[9]，說明24 ℃水溫能激活紅耳滑龜?shù)倪m應(yīng)性免疫功能，但抑制天然免疫能力，兩者間的權(quán)衡關(guān)系可能有利于維持各型白細(xì)胞的百分比處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。研究表明，28.8 ℃能顯著提升紅耳滑龜B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，但對(duì)其吞噬功能無明顯影響[2,14]。

N/L的比值和血漿皮質(zhì)酮含量都可用于指示脊椎動(dòng)物的應(yīng)激狀態(tài)，但兩者隨時(shí)間變化的反應(yīng)模式不同，N/L的比值通常反應(yīng)較慢，可能與免疫指標(biāo)負(fù)相關(guān)，但也有不相關(guān)的試驗(yàn)證據(jù)[9]。紅耳滑龜20 ℃組和32 ℃組N/L的比值較高，24 ℃組和28 ℃組較低，而反映天然免疫能力的血漿殺菌能力24 ℃組和28 ℃組較高，20 ℃組和32 ℃組較低，說明低溫和高溫均能影響其健康狀態(tài)。北美擬鱷龜(Chelydraserpentina)和真鱷龜(Macroclemystemminckii)的血漿殺菌能力在25 ℃、30 ℃和35 ℃時(shí)最高，且無種間差異，但在10 ℃、20 ℃和40 ℃時(shí)前者顯著高于后者，這可能與前者分布區(qū)廣和易于耐受溫度刺激有關(guān)[15]。從5月初至9月初，紅耳滑龜棲息地的水溫逐漸上升，血漿殺菌能力5月底、6月中旬和7月中旬都顯著高于5月初、8月初和9月初[12]，而沙漠地鼠龜?shù)难獫{殺菌能力與N/L的比值不相關(guān)，從冬季至春季呈持續(xù)下降趨勢(shì)[16]。將普通麝香龜(Sternotherusodoratus)暴露于5 ℃或10 ℃ 48 h后，可通過增強(qiáng)的殺菌能力和吞噬能力來快速適應(yīng)溫度變化[4]。北美擬鱷龜中，在-80 ℃冷凍血漿樣品6周，或者30 min解凍后再冷凍，除檢出5%～6%的批間差外，血漿殺菌能力不受凍融條件的影響，重復(fù)性好[17]。紅耳滑龜血漿殺菌能力的變化提示24 ℃和28 ℃的水溫有助于其存活，20 ℃的低溫和32 ℃的高溫會(huì)損害其天然免疫能力。

在溫和的溫度波動(dòng)范圍內(nèi)，紅耳滑龜通過血液中淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的百分比的變化來應(yīng)對(duì)溫度波動(dòng)，這些改變有利于紅耳滑龜快速適應(yīng)變溫環(huán)境，可能是其在野外易于擴(kuò)散的生理學(xué)基礎(chǔ)之一。然而，關(guān)于極端環(huán)境溫度對(duì)紅耳滑龜免疫功能的影響，尚需進(jìn)一步深入研究。