姚婧婷，尤向峰，李明珠，葛 寧，馮學(xué)松，劉欣超，顧有方，李文超*

(1.安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100；2.廣德市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，安徽宣城 242200)

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳球蟲(chóng)寄生于雞腸道引起的一種嚴(yán)重的原蟲(chóng)病，臨床上常見(jiàn)多發(fā)，可給養(yǎng)雞造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。傳統(tǒng)上，不同雞球蟲(chóng)蟲(chóng)種的鑒定主要依賴于球蟲(chóng)卵囊和孢子囊形態(tài)、寄生部位及病變特征等，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不能精確區(qū)分不同蟲(chóng)種[2]。PCR技術(shù)因其具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，已逐漸應(yīng)用到球蟲(chóng)分類領(lǐng)域。目前，已發(fā)展了不少鑒別不同種雞球蟲(chóng)的PCR方法，常用的靶基因有18S rDNA、5S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer 1，ITS，包括ITS-1和 ITS-2)以及特征序列擴(kuò)增區(qū)(sequence characterized amplified regions,SCAR)基因等，其中基于ITS基因的PCR已廣泛應(yīng)用于雞球蟲(chóng)病的診斷及流行病學(xué)調(diào)查中[2-4]。

國(guó)內(nèi)有關(guān)雞球蟲(chóng)病流行病學(xué)方面的研究較多，但相關(guān)研究基本上是采用飽和鹽水漂浮糞便，鏡檢觀察卵囊形態(tài)進(jìn)而鑒別感染蟲(chóng)種的傳統(tǒng)方法[5]。國(guó)內(nèi)采用分子生物學(xué)方法對(duì)雞球蟲(chóng)進(jìn)行調(diào)查的報(bào)道不多，目前僅見(jiàn)山東省、浙江省和安徽省有相關(guān)報(bào)道[6-9]。安徽省是養(yǎng)雞大省，已有研究顯示安徽省雞球蟲(chóng)感染率較高[8-11]。為彌補(bǔ)相關(guān)報(bào)道調(diào)查地域狹窄等不足，及時(shí)反映安徽省雞群球蟲(chóng)感染狀況，采用分子生物學(xué)方法對(duì)安徽省多地散養(yǎng)雞群球蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查，以期為安徽省雞球蟲(chóng)病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 829份新鮮雞糞便于2017年10月至2018年7月期間分別采集自安徽省滁州市明光市、淮南市鳳臺(tái)縣、阜陽(yáng)市太和縣、宿州市埇橋區(qū)、六安市金安區(qū)、宣城市寧國(guó)市的7個(gè)散養(yǎng)雞場(chǎng)。上述雞場(chǎng)飼喂雞用商品化飼料或自配飼料，一般添加有馬杜拉霉素或地克珠利等抗球蟲(chóng)藥物，且以前從未使用過(guò)任何球蟲(chóng)疫苗產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；重組TaqDNA聚合酶，三羧酸脫氧核糖核苷酸混合液dNTP，DNA標(biāo)志物(DNA Marker DL 2 000)，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 T100型梯度PCR儀、電泳儀、電泳槽，Bio-Rad公司產(chǎn)品；Tan2500R凝膠圖像處理系統(tǒng)，天能公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糞便基因組DNA提取 參照糞便基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所得DNA置-20 ℃保存。

1.2.2 艾美耳球蟲(chóng)的PCR擴(kuò)增 7種艾美耳球蟲(chóng)ITS-1基因的擴(kuò)增參照Lew A E等[2]的引物與方法。引物見(jiàn)表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。兩輪PCR反應(yīng)體系均為25 μL，包括0.15 μL rTaq酶(5 U/μL)，2 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2.5 μL 10×PCR緩沖液，0.25 μL正反引物(20 mol/L)，模板2 μL。首輪PCR引物為艾美耳屬球蟲(chóng)特異性引物，模板用提取的雞糞便基因組DNA，反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸15 min。第二輪PCR引物分別為7種艾美耳球蟲(chóng)種特異性引物，模板為2 μL首輪PCR產(chǎn)物，反應(yīng)條件除退火溫度外，其余與首輪PCR條件一致(表1)。

表1 本研究中所用的PCR引物及條件

續(xù)表1

1.2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及分析 所有第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)PCR預(yù)期擴(kuò)增片段的情況來(lái)統(tǒng)計(jì)相應(yīng)球蟲(chóng)蟲(chóng)種的感染情況。為進(jìn)一步驗(yàn)證所獲不同艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)性樣本的真實(shí)性，從7種雞艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)性樣本中隨機(jī)各挑選5個(gè)第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。所得序列經(jīng)DNAMan v9.0軟件軟件進(jìn)行比對(duì)和加工，在GenBank中進(jìn)行Blast搜索，以驗(yàn)證其是否是相應(yīng)雞球蟲(chóng)ITS-1序列。

2 結(jié)果

2.1 多種艾美耳球蟲(chóng)ITS-1基因PCR擴(kuò)增及序列分析

829份樣本，共擴(kuò)增出57份柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriatenella)、172份E.acervulina、173份E.maxima、20份毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimerianecatrix)、17份布氏艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriabrunetti)、147份E.mitis和6份早熟艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriapraecox)陽(yáng)性樣本，擴(kuò)增產(chǎn)物大小均符合預(yù)期，見(jiàn)圖1和圖2。隨機(jī)選取測(cè)序的35個(gè)艾美耳球蟲(chóng)ITS-1基因均測(cè)序成功，序列經(jīng)分析，均為雞7種艾美耳球蟲(chóng)ITS-1基因。

2.2 安徽省散養(yǎng)雞艾美耳球蟲(chóng)感染情況

PCR檢測(cè)顯示，本次調(diào)查的所有散養(yǎng)雞場(chǎng)均有球蟲(chóng)感染，場(chǎng)感染率為100%?；茨想u場(chǎng)檢出所有7種球蟲(chóng)，滁州、宿州和宣城1雞場(chǎng)檢出6種球蟲(chóng)，其余4個(gè)雞場(chǎng)均檢出4種雞球蟲(chóng)。E.acervulina、E.maxima和E.mitis是本次調(diào)查最常見(jiàn)的蟲(chóng)種，感染率分別為20.75%、20.87%和17.73%，其次是E.praecox(7.24%)、E.tenella(6.88 %)、E.necatrix(2.41%)和E.brunetti(2.05%)。其中，E.tenella在除宿州外的其他雞場(chǎng)均有檢出，感染率為0～11.72%，E.acervulina在所有雞場(chǎng)均有檢出，感染率為10.74%～44.00%，E.maxima也在所有雞場(chǎng)均有檢出，感染率為10.74%～29.31%，E.necatrix在宿州、淮南、宣城1和六安4個(gè)雞場(chǎng)均有檢出，感染率為0～9.48%，E.brunetti除六安外的其他雞場(chǎng)均有檢出，感染率為0～5.17%，E.mitis也在所有雞場(chǎng)均有檢出，感染率為1.65%～59.26%，E.praecox在滁州、宿州和淮南3個(gè)雞場(chǎng)檢出，感染率為0～8.00%(表2)。混合感染很普遍，尤以E.acervulina+E.maxima，E.acervulina+E.mitis，E.maxima+E.mitis及E.acervulina+E.maxima+E.mitis混合感染較為常見(jiàn)，其中E.acervulina和E.maxima是最常參與混合感染的蟲(chóng)種(表3)。

表3 安徽省散養(yǎng)雞群球蟲(chóng)混合感染情況

A.Mit1；B.Mit5;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～7.樣品

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～5.樣品

3 討論

對(duì)球蟲(chóng)感染進(jìn)行定期檢測(cè)與監(jiān)測(cè)，是預(yù)防雞球蟲(chóng)病的有效手段[3]。基于PCR的分子生物學(xué)檢測(cè)方法不僅可精準(zhǔn)鑒定不同球蟲(chóng)蟲(chóng)種，還可定量球蟲(chóng)感染強(qiáng)度及精確監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中的球蟲(chóng)分布等，而且該類方法在大批量樣品檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)[5]。本研究利用不同種雞球蟲(chóng)ITS-1基因的套式PCR對(duì)安徽省多地散養(yǎng)雞7種球蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查，以期為我省散養(yǎng)雞球蟲(chóng)病防控提供參考。

本研究中，所調(diào)查的7個(gè)雞場(chǎng)均檢出有球蟲(chóng)感染，場(chǎng)感染率為100%，這一結(jié)果與多個(gè)有關(guān)安徽省雞群球蟲(chóng)流行的報(bào)道一致，顯示安徽省雞群球蟲(chóng)感染情況比較普遍[8-11]。分析其原因，可能與安徽省氣候條件比較適合球蟲(chóng)發(fā)育及雞場(chǎng)飼養(yǎng)管理不規(guī)范有一定的關(guān)系，尤其是散養(yǎng)雞場(chǎng)，多采用地面平養(yǎng)方式，雞場(chǎng)衛(wèi)生條件較差，飼養(yǎng)管理較為粗放，雞在地面自由采食，非常容易攝入球蟲(chóng)孢子化卵囊而感染。本研究中，各雞場(chǎng)均有球蟲(chóng)檢出，但雞群并沒(méi)有明顯的球蟲(chóng)病臨床癥狀，顯示雞群可能處于亞臨床感染狀態(tài)，可因增重緩慢和降低飼料報(bào)酬而造成巨大的隱性經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)引起高度重視[7]。此外，本研究中安徽省散養(yǎng)雞群球蟲(chóng)感染率很高，而本次調(diào)查的雞群在日常養(yǎng)殖中均使用抗球蟲(chóng)藥進(jìn)行預(yù)防，提示在上述散養(yǎng)雞群中可能存在較為廣泛的球蟲(chóng)耐藥蟲(chóng)株的流行[6]。

從球蟲(chóng)蟲(chóng)種的分布情況來(lái)看，本次共檢獲7種雞球蟲(chóng)，這一結(jié)果與山東省和安徽省的相關(guān)報(bào)道一致[6,9-10]。Huang Y等[8]對(duì)安徽省規(guī)模化雞場(chǎng)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)存在6種球蟲(chóng)蟲(chóng)種，而浙江省及其他關(guān)于安徽省雞群的相關(guān)報(bào)道均檢出5種球蟲(chóng)蟲(chóng)種[7,11]。本研究中，E.acervulina、E.maxima和E.mitis是最常見(jiàn)的蟲(chóng)種，這一結(jié)果與山東省、浙江省及安徽省的多個(gè)相關(guān)報(bào)道不同，顯示雞球蟲(chóng)在不同地理區(qū)域的分布和流行不盡相同[6-11]。研究顯示，擁擠效應(yīng)和艾美耳球蟲(chóng)種間的相互作用是影響球蟲(chóng)卵囊產(chǎn)生的最重要因素，E.acervulina有最高的生殖潛力，在混合感染的情況下，E.acervulina能降低E.brunetti,E.maxima,E.tenella和E.necatrix的卵囊產(chǎn)量[3,8]。本研究中，E.acervulina是最頻繁參與混合感染的球蟲(chóng)蟲(chóng)種，這可能是本研究中臨床上危害最為嚴(yán)重的球蟲(chóng)蟲(chóng)種E.tenella感染率不高的一個(gè)重要原因。

綜上所述，本研究顯示安徽省散養(yǎng)雞群中球蟲(chóng)的感染率較高，故應(yīng)采取綜合性措施加強(qiáng)對(duì)球蟲(chóng)感染的防控，E.acervulina、E.maxima和E.mitis等3種蟲(chóng)種是防控的重點(diǎn)。其次，在應(yīng)用球蟲(chóng)藥物防控球蟲(chóng)病時(shí)，要高度重視球蟲(chóng)的耐藥性問(wèn)題，尤其是在禁止使用化學(xué)藥物的背景下，可采用中草藥抗球蟲(chóng)或雞球蟲(chóng)疫苗免疫的方法來(lái)預(yù)防球蟲(chóng)病[5]。