陳萬昭，軒慧勇，宋超慧，王 東，徐琦琦，秦 蕾，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

腸球菌屬是人、犬、禽、豬、馬等動物胃腸道中常在菌群之一，也是條件致病菌，廣泛分布于土壤、水和食物中[1]。腸球菌屬有50余種，而糞腸球菌和屎腸球菌可占分離株的80.0%以上[2]。近年來，隨著腸球菌對抗菌藥物的耐藥性增加，導(dǎo)致腸球菌感染治療失敗[3]，而糞腸球菌亦成為全球范圍流行的第三大院內(nèi)感染病原菌[4]。

腸球菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，對克林霉素、頭孢類抗菌藥物具有固有耐藥[5]，此外它還具有顯著的基因組可塑性，利用質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和插入序列高效獲取和轉(zhuǎn)移可移動抗性元件[3]，所以腸球菌可以作為腸道中其他致病菌耐藥基因的“蓄水池”，促進(jìn)耐藥性的傳播[6]。

規(guī)?；i場由于耐藥導(dǎo)致的治療失敗，不僅影響?zhàn)B殖場經(jīng)濟(jì)收益，還危害人類健康。此外，豬不同日齡的生理情況與飼養(yǎng)條件不同，使用抗菌藥物的幾率也不同，所以針對不同日齡合理使用抗菌藥物，藥效更佳，同時(shí)也有助于降低細(xì)菌的耐藥性。因此，本研究通過對新疆昌吉地區(qū)某規(guī)模化豬場不同日齡糞腸球菌進(jìn)行耐藥性調(diào)查以及相關(guān)耐藥基因檢測，旨在了解該豬場不同日齡糞腸球菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥基因攜帶情況，為不同日齡糞腸球菌臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2019年11月11日-12日，在新疆昌吉地區(qū)某規(guī)?；i場采集不同生長階段豬肛拭子樣品共計(jì)262份(其中育肥豬103份、妊娠豬65份、保育豬55份、后備豬39份)。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控糞腸球菌ATCC29212與金黃色葡萄球ATCC29213，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 腦浸出液(BHI)肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；MH肉湯、腸球菌選擇培養(yǎng)基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂)，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；尿道菌群定位顯色培養(yǎng)基，法國科瑪嘉產(chǎn)品；1×TE緩沖液，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR MasterMix，DL 2 000 DNA Maker，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 伯樂T100梯度PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電泳儀，電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定 用滅菌棉簽沾取豬只肛門內(nèi)新鮮糞便，放入裝有1 mL MH肉湯的EP管中。吸取10 μL MH肉湯中的樣品至1 mL 65 mg/mL氯化鈉BHI肉湯中，過夜培養(yǎng)后將增菌液劃線接種于腸球菌選擇培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h～20 h后，挑取白色圓滑、凸起、大小適中且菌落周圍顯黑色的單一菌落，置于1 mL BHI肉湯，過夜培養(yǎng)后將增菌液劃線接種于尿道菌群定位顯色培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h～20 h后挑取大小合適的藍(lán)綠色單菌落于1 mL BHI肉湯，42 ℃培養(yǎng)16 h～20 h，初步鑒定為腸球菌。通過PCR對糞腸球菌持家基因進(jìn)行擴(kuò)增[7]，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)加核酸染料的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的片段進(jìn)行膠回收并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果用Blast進(jìn)行序列比對，同源性>96.0%的結(jié)果判定為該菌株為糞腸球菌。

1.2.2 菌株保存 確定為糞腸球菌的菌株接種在BHI肉湯隔夜培養(yǎng)后，加入滅菌甘油，制成的200 mL/L甘油菌，置-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)推薦的動物源細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)瓊脂稀釋法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)操作[8]，對分離的糞腸球菌進(jìn)行11種抗菌藥物的最小抑菌濃度測定，測試菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果以耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)來表示。

1.2.4 耐藥基因的檢測 據(jù)參考文獻(xiàn)[9～16]已有序列合成引物(引物序列見表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，將目的片段進(jìn)行膠回收并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)Blast進(jìn)行序列比對后確定基因型。

表1 耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌的分離鑒定結(jié)果

共采集昌吉地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)豬場肛拭子262份樣品，經(jīng)分離鑒定得到163株糞腸球菌，分離率為62.2%。各類樣品的分離率如下：妊娠母豬源糞腸球菌57株，分離率87.7%(57/65)；保育肥豬源糞腸球菌64株，分離率62.1%(64/103)；育肥豬源糞腸球菌30株，分離率54.5%(30/55)；后備豬源糞腸球菌12株，分離率30.8%(12/39)。

2.2 糞腸球菌耐藥及多藥耐藥結(jié)果

豬源糞腸球菌對被檢抗菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該豬場糞腸球菌對被檢抗菌藥物中的紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素和利福平的耐藥率都超過60.0%以上，對萬古霉素和氨芐西林高度敏感，無耐藥菌株檢出。不同日齡豬源糞腸球菌以保育豬耐藥最嚴(yán)重，耐藥譜最寬，對被檢8種抗菌藥物的耐藥率超過40.0%，對氟苯尼考(60.0%)和利奈唑胺(26.6%)的耐藥率高于其他豬源糞腸球菌；妊娠豬耐藥率次之，對被檢7種抗菌藥物的耐藥率超過50.0%，對恩諾沙星(68.4%)的耐藥率高于其他豬源糞腸球菌；后備豬對被檢6種抗菌藥物的耐藥率超過50.0%；育肥豬源糞腸球菌對被檢的5種抗菌藥物耐藥率超過50.0%，僅檢出2株菌對氟苯尼考耐藥，檢出24株菌對慶大霉素耐藥，對萬古霉素、利奈唑胺和氨芐西林無耐藥菌株檢出。不同日齡豬源糞腸球菌對11種抗菌藥物耐藥結(jié)果詳見表2。

表2 不同日齡豬源糞腸球菌的耐藥率

該豬場不同日齡豬源糞腸球菌的多藥耐藥率為100.0%。保育豬源糞腸球菌多藥耐藥分布最廣，在5～9耐均有分布，以6～7耐為主，占60.0%，且在8耐(16.7%)和9耐(16.7%)中所占比例比其他日齡更高；妊娠豬源糞腸球菌多藥耐藥分布在4～9耐，在7耐中所占比例最高，達(dá)50.9%；后備豬源糞腸球菌多藥耐藥也分布在4～9耐，但在6耐中所占比例最高，達(dá)58.3%；育肥豬源糞腸球菌多藥耐藥分布在3～6耐，在5耐中所占比例最高，達(dá)57.8%。不同日齡豬源糞腸球菌的多藥耐藥結(jié)果詳見表3。

表3 不同日齡豬源糞腸球菌的多藥耐藥結(jié)果

2.3 糞腸球菌耐藥基因檢出結(jié)果

耐藥基因檢出結(jié)果顯示，豬源糞腸球菌除cfr和vanA基因未檢出外，對被檢的其他8種耐藥基因均有檢出，對tetM(100.0%)檢出率最高，對aac(6′)-Ie-aph(2″)-Ia、aph(3′)-Ⅲ和ermB基因的檢出率也高達(dá)95.0%以上。不同日齡豬源糞腸球菌耐藥基因檢出結(jié)果顯示，保育豬源糞腸球菌耐藥基因攜帶率最高，tetK(33.3%)、fexA(60.0%)和optrA(56.7%)基因攜帶率高于其他日齡豬源糞腸球菌，育肥豬源糞腸球菌對10種被檢基因中的7種耐藥基因有檢出，且ermA基因(5.0%)只在育肥豬源糞腸菌株中檢出。不同日齡豬源糞腸球菌耐藥基因檢測結(jié)果詳見表4。

表4 不同日齡豬源糞腸球菌耐藥基因檢出結(jié)果

3 討論

糞腸球菌作為腸球菌屬中的重要種，很易被誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性，成為多種耐藥基因的貯存庫，并引起人和動物的多種感染。本研究以新疆某規(guī)?；i場不同日齡豬源糞腸球菌為研究對象，分析在相同的養(yǎng)殖方式下，不同日齡豬源糞腸球菌的耐藥特點(diǎn)及耐藥基因攜帶情況，對于臨床針對不同生長階段豬只用藥具有指導(dǎo)意義。糞腸球菌的整體分離率為62.2%，高于王舒豐等[17]所報(bào)道的菌株分離率，與幸文定[18]報(bào)道的豬源糞腸球菌的分離率較為相近，不同日齡豬只以妊娠母豬糞腸球菌分離率最高，達(dá)87.7%，高于姚曉慧等[19]報(bào)道的阿克蘇地區(qū)妊娠豬糞腸球菌分離率，但育肥豬和保育豬的分離率基本一致，分離結(jié)果顯示，糞腸球菌作為腸道共生菌在不同生長階段豬只中具有較高分離率，且在不同生長階段豬只體內(nèi)的比例具有一定差異性。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，不同日齡豬源糞腸球菌對四環(huán)素和紅霉素的高耐藥率與王蒙蒙等[20]報(bào)道的新疆北疆地區(qū)糞腸球菌的耐藥結(jié)果基本一致，分析高耐藥率產(chǎn)生的原因，是由于四環(huán)素類與大環(huán)內(nèi)酯類的一些抗菌藥物屬于我國批準(zhǔn)的飼料藥物添加劑，從而導(dǎo)致菌株對其耐藥嚴(yán)重；值得注意的是，除保育豬對氟苯尼考的耐藥率達(dá)60.0%以外，其余日齡豬源糞腸球菌對氟苯尼考的耐藥率僅在3.1%～8.3%之間，但整體對氟苯尼考的中介率卻高達(dá)70.6%，為防止短時(shí)間內(nèi)耐藥菌株的大量出現(xiàn)，該養(yǎng)殖場應(yīng)注意氟苯尼考的規(guī)范使用，通過聯(lián)合用藥或輪換用藥減少氟苯尼考耐藥菌株的出現(xiàn)。除育肥豬外，不同日齡豬源糞腸球菌對利奈唑胺均有耐藥菌株檢出，以保育豬的耐藥率最高(為30.0%)，后備豬與妊娠豬分別為8.3%與1.7%，遠(yuǎn)高于魏蓮花等[21]的報(bào)道，雖然該場分離菌株對其敏感性良好，也應(yīng)嚴(yán)格控制藥物的使用，避免利奈唑胺耐藥菌株的暴發(fā)。

該養(yǎng)殖場分離菌株的多藥耐藥集中在5～7耐，耐藥譜型以ERY-TET-DOX-RFP-AMK-GEN為主。不同日齡糞腸球菌以保育豬的多藥耐藥分布最廣，耐藥率最高，耐藥情況最為嚴(yán)重，妊娠豬與后備豬次之。分析其原因可能是，保育豬自身的生理功能尚未完全成熟，失去母源抗體的條件下，易被外來病原菌侵入而引發(fā)疾病[17]，此外，該豬場用藥調(diào)查顯示，在保育階段，使用抗菌藥物幾率更高，也是導(dǎo)致分離菌株耐藥嚴(yán)重的原因之一。妊娠豬與后備豬由于養(yǎng)殖周期長，使用抗菌藥物的幾率高，從而導(dǎo)致高耐藥率的產(chǎn)生。該豬場可結(jié)合不同日齡的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，在目前的用藥模式上針對不同日齡合理選用具有較高敏感性的抗菌藥物，在提高治療效果降低經(jīng)濟(jì)成本的同時(shí)，也可緩解該養(yǎng)殖場細(xì)菌耐藥嚴(yán)重的情況。

本研究耐藥基因檢測結(jié)果顯示，該場豬源糞腸球菌耐藥基因攜帶率與耐藥表型基本一致。對酰胺醇類藥物的耐藥率為14.1%，對酰胺醇類fexA基因檢出率為17.8%。四環(huán)素類藥物的耐藥率為100.0%，介導(dǎo)四環(huán)素類藥物耐藥的基因主要是tetM，該基因的檢出率為100.0%，但tetK基因檢出率未超過10.0%，與Molechan C等[22]報(bào)道的一致；對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的菌株大多攜帶ermB基因，對氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)-Ie-aph(2″)-Ia和aph(3′)-Ⅲ的檢出率相同，為98.8%，對氨基糖苷類耐藥率達(dá)到79.1%，中介率為20.9%，結(jié)果印證Osei Sekyere J等[23]報(bào)道的藥敏試驗(yàn)中介的菌株也可能擴(kuò)增出相應(yīng)耐藥基因的情況。保育豬源糞腸球菌耐藥基因攜帶率高，對fexA、optrA和tetK基因的攜帶率明顯高于其他日齡，尤其是對2015年新發(fā)現(xiàn)的惡唑烷酮類耐藥基因optrA的檢出率高達(dá)13.5%。該基因不僅介導(dǎo)對酰胺醇類抗菌藥物和利奈唑胺的耐藥，還可介導(dǎo)對2014年被美國FDA批準(zhǔn)上市的新一代惡唑烷酮類藥物——泰地唑利的耐藥，該藥被批準(zhǔn)用于臨床治療耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和耐甲氧西林的凝固酶陰性的葡萄球菌(methicillin-resistant coagulase negativeStaphylococci，MRCoNS)等多重耐藥菌引起的感染[12]。耐藥基因的攜帶必然會影響相應(yīng)抗菌藥物的治療效果，影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展，還嚴(yán)重危害人類的健康。如不加以控制，可能會造成“無藥可用”的境地[24]。因此，應(yīng)密切監(jiān)測耐藥糞腸球菌，預(yù)防耐藥菌暴發(fā)，并通過更深入的研究和調(diào)查來探究糞腸球菌耐藥機(jī)制產(chǎn)生的原因。

綜上所述，通過檢測發(fā)現(xiàn)新疆昌吉地區(qū)某規(guī)模化豬場不同日齡豬源糞腸球菌對四環(huán)素、紅霉素、多西環(huán)素和利福平的耐藥率高，應(yīng)減少這四類藥物的使用。此外，保育豬耐藥率高，耐藥譜寬，耐藥基因攜帶率高，應(yīng)嚴(yán)格控制抗菌藥物在保育豬中的使用。在不同日齡豬源糞腸球菌中均檢出惡唑烷酮類耐藥基因optrA，提示應(yīng)該在養(yǎng)殖場禁用惡唑烷酮類藥物。該豬場可結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理使用抗菌藥物，同時(shí)相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物的規(guī)范使用，降低細(xì)菌的耐藥性。