劉 磊, 管紅香, 許蘭芳, 茅晟懿, 劉麗華, 陳宗恒, 陶 軍

南海冷泉活動(dòng)區(qū)雙殼類生物中單不飽和脂肪酸雙鍵位置的確定及其意義

劉 磊1,3, 管紅香1*, 許蘭芳1,3, 茅晟懿1, 劉麗華1, 陳宗恒2, 陶 軍2

(1. 中國(guó)科學(xué)院 廣州能源研究所 天然氣水合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510640; 2. 廣州海洋地質(zhì)調(diào)查局 廣東 廣州 510075; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

本次研究對(duì)南海冷泉活動(dòng)區(qū)福爾摩沙脊(F站位)、海馬冷泉環(huán)境中與甲烷有氧氧化菌共生的貽貝(分別為和), 以及與硫氧化菌共生的蛤()腮組織中的單不飽和脂肪酸進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 貽貝鰓組織中存在C16∶1ω9、C16∶1ω8和C18∶1ω8脂肪酸, 同時(shí)C16∶1ω8的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C18∶1ω8, 這說明與貽貝共生的為Ⅰ型甲烷有氧氧化菌。在蛤腮組織中, 單不飽和脂肪酸C16∶1ω7、C18∶1ω7和C20∶1ω7含量極高, 表明ω7脂肪酸來源于硫氧化菌。同時(shí), 貽貝和蛤鰓中含有大量多不飽和脂肪酸, 如C20∶2和C22∶2。在同一樣品中來源于共生菌的單不飽和脂肪酸和來源于宿主的多不飽和脂肪酸具有相近的13C值, 表明宿主從共生菌或共生菌代謝產(chǎn)物中獲得碳源和營(yíng)養(yǎng)。Ⅰ型甲烷有氧氧化菌在貽貝腮組織中廣泛存在, 指示F站位和海馬冷泉活動(dòng)區(qū)冷泉流體滲漏強(qiáng)度較弱。確定單不飽和脂肪酸的類型是判斷雙殼共生菌種類的基礎(chǔ)。雙殼類共生菌類型的識(shí)別, 可以幫助理解共生體與宿主之間碳源和能量的轉(zhuǎn)化關(guān)系、冷泉環(huán)境中甲烷的消耗過程如碳同化途徑、碳循環(huán)等。

單不飽和脂肪酸; 二甲基二硫化合物; 順或反異構(gòu); 穩(wěn)定碳同位素; 南海

0 引 言

來自熱液噴口和冷泉的無脊椎動(dòng)物, 如貽貝雙殼類、腹足類、管狀蠕蟲或海綿等, 通過與細(xì)菌共生而獲得碳源和營(yíng)養(yǎng)[1-5]。共生菌通過氧化硫化物或甲烷獲得碳源和能量, 同時(shí)O2作為電子受體接受電子[6]。雙殼類則通過將自身固定在富甲烷和含有O2的氧化還原界面為共生菌提供一個(gè)同時(shí)具有電子供體和受體的穩(wěn)定環(huán)境[6]。能通過化能共生獲得碳源和能量的貽貝最初在熱液噴口被發(fā)現(xiàn)[7]。通過光學(xué)和透射電子顯微鏡觀察, Childress.[5]對(duì)比了墨西哥貽貝腮組織與周圍甲烷源的13C特征, 從而證實(shí)了甲烷有氧氧化菌與貽貝的共生關(guān)系。隨后, Brooks.[4]對(duì)美國(guó)墨西哥灣大陸坡采集的管狀蠕蟲和蛤類進(jìn)行了酶試驗(yàn)、硫元素分析和CO2固定方式研究, 結(jié)果表明, 它們與細(xì)胞內(nèi)的硫氧化菌共生。到目前為止, 冷泉活動(dòng)區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10多種深海貽貝雙殼類[8-11]。相關(guān)研究已經(jīng)證明, 冷泉雙殼類可以作為寄主分別與硫氧化菌[12-13]或甲烷有氧氧化菌共生[5,8], 也可以同時(shí)與這兩種細(xì)菌共生[14]。迄今為止, 熱液噴口和冷泉中的內(nèi)共生菌培養(yǎng)還沒有成功。這些共生菌的多樣性、代謝, 以及宿主與共生體之間共生關(guān)系的證據(jù)主要來自于對(duì)共生宿主軟組織的研究[2,6]。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)或原生環(huán)境中, 以甲烷為營(yíng)養(yǎng)物的化能合成細(xì)菌, 如甲烷有氧氧化菌, 其脂類生物標(biāo)志物表現(xiàn)出極虧損13C的特征[15-17]。具體來說, 甲烷有氧氧化菌和硫氧化菌分別以單不飽和脂肪酸C16∶1ω9、C16∶1ω8、C18∶1ω8和C16∶1ω7、C18∶1ω7為特征[17-20]; 此外, Ⅰ、Ⅱ和X型甲烷有氧氧化菌被證明含有不同類型的脂類生物標(biāo)志物, 例如單不飽和脂肪酸C16: 1ω8含量在Ⅰ型和X型甲烷有氧氧化菌中很高; 而C18∶1ω8脂肪酸是Ⅱ型甲烷有氧氧化菌的主要成分[18-19]。同時(shí), 貽貝組織中發(fā)現(xiàn)的多不飽和脂肪酸如C18∶3、C20∶2&3和C22∶2被認(rèn)為是宿主貽貝來源, 因?yàn)樗鼈冊(cè)诤Ｑ鬅o脊椎動(dòng)物中占主導(dǎo)地位, 并且未在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)[21]。因此, 特定的脂類生物標(biāo)志物可進(jìn)一步用于區(qū)分甲烷有氧氧化菌的類型, 同時(shí)對(duì)碳利用路徑具有重要意義, 因?yàn)棰裥秃蚗型甲烷有氧氧化菌通過磷酸核酮糖途徑吸收碳[21], 而Ⅱ型甲烷有氧氧化菌則通過絲氨酸途徑[22]。共生菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明, 在低甲烷含量、高氧條件下, Ⅰ型甲烷有氧氧化菌比較活躍, 而高甲烷和低氧環(huán)境對(duì)Ⅱ型甲烷有氧氧化菌的生長(zhǎng)有利[23-25]。

但是目前質(zhì)譜直接測(cè)試單不飽和脂肪酸雙鍵位置存在很大困難, 一方面在離子源轟擊下, C═C不容易發(fā)生裂解; 另一方面在形成分子離子后, 氫原子容易發(fā)生沿碳鏈的重排, 所以根據(jù)質(zhì)譜特征碎片離子難以判斷雙鍵在碳鏈中的位置[26-28]。為了確定沉積物和生物中的不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu), 很多雙鍵衍生化方法被應(yīng)用到實(shí)踐中來[29-33]。大多數(shù)識(shí)別單不飽和脂肪酸雙鍵位置的方法, 因?yàn)槿唛L(zhǎng)的樣品處理過程、不適用于碳數(shù)大于24的單不飽和脂肪酸以及無法區(qū)分順或反異構(gòu)體等原因, 而未被廣泛地應(yīng)用于環(huán)境學(xué)和微生物研究中。目前, 常用的是一種單步驟衍生化與氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用的分析方法, 主要步驟包括碘催化線性烯烴, 然后向其中添加二甲基二硫化物(DMDS)并進(jìn)行加熱生成脂肪酸甲酯二甲基二硫化物衍生物的方法[29,34-35]。該方法具有轉(zhuǎn)化率高、步驟少和操作方便等優(yōu)點(diǎn), 能夠成功實(shí)現(xiàn)單不飽和脂肪酸雙鍵位置的識(shí)別及順或反異構(gòu)的判定[26,35-37]。實(shí)際上, 對(duì)于很多生物樣品來說, 確定長(zhǎng)鏈不飽和化合物中雙鍵的位置是確定具體生物標(biāo)志物的先決條件, 如單不飽和脂肪酸、長(zhǎng)鏈不飽和烯烴等[38-40]。二甲基二硫化物衍生化最開始應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室合成的樣品中[39], 逐漸應(yīng)用到昆蟲信息素[31]、土壤和海洋等各種樣品中[35,38]。但是實(shí)驗(yàn)過程中, 試劑用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的控制會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)的效率與結(jié)果[38]。二甲基二硫化物衍生單不飽和脂肪酸的基本原理是: 對(duì)其原雙鍵位置進(jìn)行加成, 從而形成易于檢測(cè)的含甲硫基化合物(圖1)。Nichols.[35]在對(duì)單不飽和脂肪甲酯進(jìn)行衍生化實(shí)驗(yàn)時(shí)用到的試劑為二甲基二硫化物100 μL、反應(yīng)時(shí)間48 h和反應(yīng)溫度50℃(表1); Scribe.[42]在單不飽和脂肪酸甲酯二甲基二硫化物衍生化時(shí), 多添加了1.2 mg I2。Richter.[38]在對(duì)比前人研究的基礎(chǔ)上, 認(rèn)為I2是作為催化劑參與二甲基二硫化物衍生化中并且給出了相關(guān)的催化機(jī)理。本次研究主要是為了確定海洋生物樣品中單不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)(圖1), 實(shí)驗(yàn)從脂肪酸甲酯開始[37]。選擇添加稍過量的I2, 以達(dá)到充分轉(zhuǎn)換C═C的目的[42]。在衍生化反應(yīng)結(jié)束后, 適量的硫代硫酸鈉水溶液可以反應(yīng)未消耗完的I2。Richter.[38]衍生化烯酮時(shí), 通過實(shí)驗(yàn)觀測(cè)得出較低的反應(yīng)溫度、適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時(shí)間以及I2催化劑可以實(shí)現(xiàn)最佳的烯酮檢測(cè)效果。而對(duì)于單不飽和脂肪酸甲酯來說, 最佳的衍生化條件為過量的I2、100 μL 二甲基二硫化物、50 ℃的溫度和48 h的反應(yīng)時(shí)間[35,38]。

單不飽和脂肪酸是判斷海洋雙殼類共生菌類型的重要指標(biāo)。本次研究基于南海冷泉活動(dòng)區(qū)生物樣品(兩種貽貝:和; 一種蛤:), 應(yīng)用二甲基二硫化物衍生化程序和GC-MS檢測(cè), 識(shí)別單不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu), 對(duì)比穩(wěn)定碳同位素13C值, 進(jìn)而分析共生菌類別, 碳代謝機(jī)制、宿主-共生菌的碳源和能量轉(zhuǎn)化關(guān)系, 旨在探討單不飽和脂肪酸作為生物標(biāo)志物判別海洋雙殼類共生菌類型的適用性, 為后續(xù)分析碳循環(huán)途徑及冷泉區(qū)甲烷滲漏環(huán)境奠定基礎(chǔ)。

圖1 單不飽和脂肪酸衍生化過程及GC-MS檢測(cè)示意圖, 修改自文獻(xiàn)[30]

表1 前人二甲基二硫化物衍生化最佳實(shí)驗(yàn)條件和試劑等情況對(duì)比

注: “/”表示未添加。

1 樣品采集及實(shí)驗(yàn)方法

1.1 樣品采集和保存

2018年5月嘉庚號(hào)航次期間, 無人遙控潛水器(ROV)“ROPOS號(hào)”從南海冷泉活動(dòng)區(qū)福爾摩沙脊(F站位, 水深1120 m)采集了貽貝[43-44]。2019年5月, “海馬號(hào)”無人遙控潛水器在南海西北部海馬冷泉活動(dòng)區(qū)(1390 m)采集了貽貝和蛤樣品[8,45-46]。取樣位置如圖所示(圖2)[47]。樣品采集后在船上保存在?80 ℃的冰柜中, 隨后運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室并在?25 ℃下保存。樣品在實(shí)驗(yàn)室解剖為鰓組織、足組織和剩余組織3部分, 用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行低溫干燥并磨成粉末。

1.2 二甲基二硫化物衍生化、GC-MS和色譜-同位素比值質(zhì)譜(GC-IRMS)測(cè)試

本研究分析的樣品為貽貝、和蛤的腮組織部分, 稱取適量樣品, 用二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇(體積比為1∶1)和甲醇溶劑分別超聲提取3次, 獲得總脂類提取物(TLE)。一部分干燥的總脂類提取物加入氫氧化鉀的甲醇溶液(1 mol/L)在70℃下皂化2 h。皂化后的樣品用正己烷萃取中性組分。為了獲得脂肪酸組分, 剩余溶液加入10%鹽酸至PH=2, 然后用正己烷萃取, 獲得的脂肪酸旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并轉(zhuǎn)移至2 mL細(xì)胞瓶, 并在N2下吹干。在處理后的脂肪酸組分中加入適量三氟化硼甲醇溶液(BF3-CH3OH)試劑, 然后在60 ℃下衍生化2 h并萃取, 萃取液在N2下吹干得到不飽和脂肪酸甲酯。吹干后的樣品中加入50 μL正己烷和100 μL二甲基二硫化合物(過量), 然后再加入500 μL碘溶液(碘的乙醚溶液), 迅速向樣品中充入Ar并密封, 50℃反應(yīng)48 h, 生成脂肪酸甲酯二甲基二硫化合物衍生物(圖1)。冷卻后, 向溶液中加入適量的硫代硫酸鈉(Na2S2O3)水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)來還原I2并終止反應(yīng)(表1)[30]。最后除去有機(jī)相, 正己烷萃取3次以上獲得脂肪酸甲酯二甲基二硫化合物衍生物, 吹干并轉(zhuǎn)移至2 mL細(xì)胞瓶, 加入適量正己烷, 用于GC-MS和GC-IRMS分析。

GC-MS分析在中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所TRACE 1300-ISQQD氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上完成。色譜柱為DB-5毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.32 mm, 內(nèi)徑×0.25 μm厚涂層)。GC-MS的升溫程序如下: 初始溫度60℃保留2 min, 以10℃/min的速率從60℃升至160℃; 以2℃/min的速率從160℃升至320℃并保留30 min。載氣為高純He, 流速為1.2 mL/min。GC-IRMS 分析在中國(guó)科學(xué)院地球化學(xué)研究所的GV Isoprime Hewlett-Packard 6890 GC色譜-同位素比值質(zhì)譜儀上完成, 升溫條件與GC-MS相同。每個(gè)樣品至少測(cè)試2次, 同位素測(cè)定誤差大部分小于0.8‰。碳同位素以表示, VPDB 標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)不飽和脂肪酸二甲基二硫化合物衍生物在分析過程中增加的碳進(jìn)行了碳同位素校正。

圖2 生物取樣位置圖, 修改自文獻(xiàn)[47]

Fig.2 Map showing the location of the sampling sites in this study, modified from reference[47]

圖中黃點(diǎn)是南海北部目前已知的甲烷滲漏點(diǎn); 紅點(diǎn)為取樣點(diǎn), 活動(dòng)冷泉。

The red dot and square are both the sampling sites and the active cold seeps. yellow dots are currently known methane leakage sites in the northern South China Sea.

2 結(jié)果及討論

2.1 單不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)分析

在氣相色譜中, 不同相對(duì)分子質(zhì)量的單不飽和脂肪酸甲酯二甲基二硫化合物衍生物依據(jù)不同保留時(shí)間能夠很好地分開(圖3)。Nichols.[35]的研究表明, 一般順式脂肪酸甲酯二甲基二硫化合物衍生物先被分離出來, 因此在色譜圖上具有較短的保留時(shí)間, 以此可以區(qū)分具有相同分子式和C═C位置的順反結(jié)構(gòu)單不飽和脂肪酸, 如圖3a中的C16∶1ω7c和C16∶1ω7t順或反異構(gòu)的判定。對(duì)于質(zhì)譜分析, 衍生物的質(zhì)譜會(huì)顯示出3個(gè)特征離子碎片峰(圖1), 分子離子峰M+的相對(duì)豐度可以達(dá)到10%～30%(相對(duì)于質(zhì)譜中的最高峰); 而脂肪烴端元(ω)碎片離子A+和羧基端元(Δ)碎片離子B+峰的相對(duì)豐度可高于50%[31]。我們通過分析衍生化后產(chǎn)物的質(zhì)譜圖, 可以判斷原單不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)和雙鍵位置。

在質(zhì)譜中, 我們按照上述原則, 可以確定單不飽和脂肪酸甲酯二甲基二硫化合物衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量、雙鍵位置[35]。圖4a、圖4b展示了ω7單不飽和脂肪酸甲酯二甲基二硫化合物衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。一般來說, 通過分子離子峰可以確定化合物的相對(duì)分子質(zhì)量[31,34,35,38], 如圖4a中分子離子峰的質(zhì)荷比為362, 確定該化合物相對(duì)分子質(zhì)量為362, 為含有16個(gè)碳的原單不飽和脂肪酸。同時(shí), 質(zhì)譜中相對(duì)豐度較高的離子峰(可高于50%)為特征峰, 雙鍵加成后帶有兩個(gè)甲硫基(圖1), 在離子源轟擊下, 容易斷裂, 形成ω-碎片離子和Δ-碎片離子峰, 如圖4a中特征離子峰的質(zhì)荷比為145(ω-碎片)和217(Δ-碎片)。由此可得出原單不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)為C16∶1ω7(圖4a)[39]。除此之外, 我們還檢測(cè)到雙鍵位置在ω8(圖4c, 圖4d)和ω9(圖4e, 圖4f)的單不飽和脂肪酸。它們的分析方法與ω7類似, 區(qū)別在于ω7的衍生物ω-碎片質(zhì)量為145, 雙鍵在ω8的衍生物ω-碎片質(zhì)量應(yīng)為159(二者相差1個(gè)亞甲基的相對(duì)分子質(zhì)量)。根據(jù)分子離子峰質(zhì)荷比為362(圖4c)可確定其為單不飽和脂肪酸C16∶1, 同時(shí)根據(jù)其特征峰(ω-碎片離子峰)質(zhì)荷比為159可判斷其雙鍵位于甲基端8號(hào)碳位, 為C16∶1ω8[27]。依此類推, 雙鍵位置在ω9的衍生物的ω-碎片質(zhì)量應(yīng)為173 (圖4e)[35,42,48]。我們按照色譜上的出峰順序, 逐次分析其質(zhì)譜, 從而確定單不飽和脂肪酸的順或反異構(gòu)、碳數(shù)和雙鍵位置等信息。本次研究對(duì)于單不飽和脂肪酸二甲基二硫化合物衍生物的分析詳細(xì)列在表2。

2.2 南海冷泉活動(dòng)區(qū)雙殼中脂肪酸分布的生物地球化學(xué)意義

在本研究中, 脂類生物標(biāo)志物C16∶1ω8、C18∶1ω8的出現(xiàn)表明, 貽貝和鰓組織中存在甲烷有氧氧化菌(表2)[16,52]。實(shí)際上, Xu.[8]分析了從海馬冷泉區(qū)采集的鰓組織中的微生物16S rRNA基因, 發(fā)現(xiàn)其中細(xì)菌主要是由3種共生γ蛋白細(xì)菌和3種ε蛋白桿菌組成; 而中含量最豐富的γ蛋白細(xì)菌與另一種種屬的甲烷營(yíng)養(yǎng)型γ蛋白細(xì)菌相似度極高, 是甲烷有氧氧化菌存在的基因?qū)W證據(jù)。貽貝和鰓組織中C16∶1ω8絕對(duì)含量遠(yuǎn)高于C18∶1ω8, 進(jìn)一步揭示了I型甲烷有氧氧化菌的存在(圖3a, 圖3b)[18-19,53]。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示, I型甲烷有氧氧化菌的脂肪酸比宿主略微虧損碳,13C差別2‰～4‰[52,54]。在海馬冷泉區(qū), 水合物分解釋放的甲烷13C值大約是?60‰[55]。前人研究表明, F站位的貽貝和海馬冷泉區(qū)貽貝軟組織的13C值變化范圍分別是?73‰～?70‰和?65‰～?56‰[56]。在本次研究中, 貽貝和腮組織中脂肪酸13C值的平均值分別為?73‰和?64‰ (圖5, 表3), 這分別與兩種宿主貽貝軟組織的13C值相接近[56], 從而表明了I型甲烷有氧氧化菌在兩種貽貝腮組織中占主導(dǎo)地位。同時(shí), 硫氧化菌的膜脂含有大量ω7單不飽和脂肪酸, 以C16∶1ω7或者C18∶1ω7為主[18], 它們?cè)谂c硫氧化菌共生的雙殼類中含量很高[16], 這種特性使得ω7單不飽和脂肪酸可以作為硫氧化菌的標(biāo)志化合物。在本研究中, 單不飽和脂肪酸 C16∶1ω7和C18∶1ω7在蛤的腮組織中含量極高(圖3c), 證明與共生的細(xì)菌為硫氧化菌。

圖3 生物樣品中脂肪酸甲酯二甲基二硫化合物衍生物的氣相色譜圖及單不飽和脂肪酸鑒定

表示順異構(gòu);表示反異構(gòu)。

圖4 典型單不飽和脂肪酸甲酯二甲基二硫化合物衍生物質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)鑒定

(a).腮組織中的C16∶1ω7二甲基二硫化合物衍生物質(zhì)譜圖及化合物結(jié)構(gòu); (b)腮組織中的C22∶1ω7二甲基二硫化合物衍生物質(zhì)譜圖及化合物結(jié)構(gòu); (c)腮組織中的C16∶1ω8二甲基二硫化合物衍生物質(zhì)譜圖及化合物結(jié)構(gòu); (d)腮組織中的C18∶1ω8二甲基二硫化合物衍生物質(zhì)譜圖及化合物結(jié)構(gòu); (e)腮組織中的C20∶1ω9二甲基二硫化合物衍生物質(zhì)譜圖及化合物結(jié)構(gòu); (f)腮組織中的C22∶1ω9二甲基二硫化合物衍生物質(zhì)譜圖及化合物結(jié)構(gòu)。

(a) DMDS adduct of C16∶1ω7in.gill tissue and structure identification; (b) C22∶1ω7ingill tissue; (c) DMDS adduct of C16∶1ω8ingill tissue; (d) DMDS adduct of C18∶1ω8ingill tissue; (e) DMDS adduct of C20∶1ω9ingill tissue; (f) DMDS adduct of C22∶1ω9ingill tissue.

穩(wěn)定碳同位素可以記錄自然環(huán)境中碳循環(huán)的信息, 示蹤共生菌和動(dòng)物宿主之間的關(guān)聯(lián)。除共生菌特有的單不飽和脂肪酸外, 長(zhǎng)鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸被證明是無脊椎宿主通過利用共生菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行合成, 比如C20∶1ω7和C22∶1ω7利用C18∶1ω7經(jīng)C2碳鏈加長(zhǎng)而產(chǎn)生[57-58]。一般來說, 動(dòng)物宿主合成多不飽和脂肪酸如C20∶2和C22∶2的過程, 首先通過加長(zhǎng)共生菌產(chǎn)生單不飽和脂肪酸的碳鏈, 然后在?5或?9處去飽和形成雙鍵[58]。值得注意的是, 貽貝還能夠?qū)16∶1碳鏈加長(zhǎng)(C2)至C18∶1, 然后再將碳鏈加長(zhǎng)至C20∶1[57]。因此, 宿主脂肪酸和共生體脂肪酸單體碳同位素的差異可用于評(píng)價(jià)共生菌對(duì)宿主碳源和能量的貢獻(xiàn)[16,52]。本次研究同一樣品中, 共生菌產(chǎn)生的單不飽和脂肪酸和宿主合成的多不飽和脂肪酸具有相近的13C值, 表明宿主直接從共生菌或共生菌代謝產(chǎn)物中獲得碳源(表3)。同時(shí), 與貽貝共生的甲烷有氧氧化菌類型也能夠反映冷泉流體的滲漏特征。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), Ⅰ型甲烷有氧氧化菌主要發(fā)育于冷泉流體滲漏強(qiáng)度較弱, 含氧量較高的冷泉環(huán)境中; 而Ⅱ型甲烷有氧氧化菌在含氧量低和甲烷分壓較高的環(huán)境中占主導(dǎo)[23-25]。在本研究中, 貽貝和鰓組織中的甲烷有氧氧化菌均為Ⅰ型, 表明福爾摩沙脊和海馬冷泉活動(dòng)區(qū)的甲烷滲漏活動(dòng)均較弱?？偟膩碚f, 單不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)和雙鍵位置的識(shí)別為微生物參與的有機(jī)生物地球化學(xué)過程分析提供了基礎(chǔ)。貽貝和鰓組織中甲烷有氧氧化菌類型的判定, 為研究南海冷泉活動(dòng)區(qū)氧化還原界面碳循環(huán)途徑和微生物消耗甲烷機(jī)理提供生物地球化學(xué)基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

(1) 二甲基二硫化合物衍生化程序和GC-MS檢測(cè), 可以實(shí)現(xiàn)色譜分離順或反異構(gòu)體, 質(zhì)譜確定單不飽和脂肪酸的雙鍵位置。

(2) 生物標(biāo)志物C16∶1ω8、C18∶1ω8的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了貽貝鰓組織中存在甲烷有氧氧化菌, 其中C16∶1ω8脂肪酸都相對(duì)高于C18∶1ω8脂肪酸, 揭示了其共生菌為Ⅰ型甲烷有氧氧化菌的特征, 從而指示F站位和海馬冷泉活動(dòng)區(qū)較弱的甲烷滲漏活動(dòng)。蛤腮組織中檢測(cè)到相對(duì)高含量的脂肪酸C16∶1ω7、C18∶1ω7和C20∶1ω7, 證明硫氧化菌的存在。

(3) 同一樣品中宿主-共生菌合成的脂肪酸具有較接近的13C特征, 表明宿主直接從共生菌或共生菌代謝產(chǎn)物中獲得碳源和能量。單不飽和脂肪酸的檢測(cè)和結(jié)構(gòu)確定是鑒別冷泉區(qū)雙殼類共生菌種類的基礎(chǔ), 對(duì)判斷海底環(huán)境、碳利用路徑分析和有機(jī)生物地球化學(xué)研究等具有重要意義。

表2 單不飽和脂肪酸甲酯二甲基二硫化合物衍生物特征離子碎片、碳數(shù)、雙鍵位置和順或反異構(gòu)判定情況

注: “ω-碎片”指含有脂肪烴的端元; “Δ-碎片”指含有羧基的端元。-腮組織;-腮組織;-腮組織。

圖5 G. haimaensis鰓組織樣品中脂肪酸的部分氣相色譜圖

表示順異構(gòu);表示反異構(gòu)。

表3 生物樣品貽貝B. platifrons、G. haimaensis和蛤A. marissinica腮組織中脂肪酸的單體碳同位素特征

注: n.d.表示未檢測(cè)到;*a表示C16∶1ω8+ C16∶1ω7。

感謝海馬號(hào)、母船海洋六號(hào)、“ROPOS”號(hào)和母船嘉庚號(hào)全體科考人員采集的生物樣品; 感謝中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所劉世君博士的技術(shù)支持。同時(shí)也感謝《地球化學(xué)》編輯部及兩位匿名審稿人對(duì)本文提出的建設(shè)性意見。

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Determination of double bond position in monounsaturated fatty acid in bivalves in active cold seeps of South China Sea and its significance

LIU Lei1,3, GUAN Hong-xiang1*, XU Lan-fang1,3, MAO Sheng-yi1, LIU Li-hua1, CHEN Zong-heng2and TAO Jun2

1. Key Laboratory of Gas Hydrate, Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China; 2. China Guangzhou Marine Geological Surveys, Guangzhou 510075, China;3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

In this study, the structures of monounsaturated fatty acids were analyzed in gill tissues of two mussels (and) and one clam (), symbiotic with methanotrophic and thiotrophic bacteria, respectively. The results showed that C16∶1ω9, C16∶1ω8, and C18∶1ω8were present in the gill tissues of both mussels, and the content of C16 : 1ω8was much higher than that of C18∶1ω8, indicating that type I methanotrophic bacteria were predominant in the gill tissues of mussels. In the clam gill tissue, the content of monounsaturated fatty acids C16∶1ω7, C18∶1ω7, and C20∶1ω7were extremely high, indicating the presence of thiotrophic bacteria.At the same time, mussel and clam gill tissues contained a large amount of polyunsaturated fatty acids, such as C20∶2and C22∶2. In the same sample, the monounsaturated fatty acids derived from symbiotic bacteria and the polyunsaturated fatty acids of the host exhibited similar13C values, which suggests the host obtained nutrition either directly from the symbionts or from symbiont-derived carbon. Type I methanotrophic bacteria were widely found in mussel gill tissues, indicating that cold spring fluid leakage intensities are weak at both site F and Haima seeps. Identifying the type of monounsaturated fatty acid is the foundation for identifying the type of symbiont bacteria in bivalves. Moreover, the study of carbon assimilation pathways, carbon cycling, and transformation between symbionts and hosts will contribute to the understanding of methane consumption under aerobic methane oxidation.

monounsaturated fatty acids; dimethyl disulfide;orisomerism;13C; South China Sea

P593; X142

A

0379-1726(2021)03-0294-11

10.19700/j.0379-1726.2021.03.007

2019-08-20;

2019-11-07;

2019-11-13

國(guó)家自然科學(xué)基金(91958105); 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室開放基金(QNLM2016ORP0210)

劉磊(1993-), 男, 碩士研究生, 海洋地質(zhì)專業(yè)。E-mail: liulei@stu.ouc.edu.cn

Corresponding author):GUAN Hong-xiang, E-mail: guanhongxiang@ouc.edu.cn; Tel: +86-20-532-66781971