黃子凌,莫港澳,李文,王陶*

1(徐州工程學院,江蘇 徐州,221018) 2(江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室,江蘇 徐州,221018)

中性蛋白酶是其最適作用 pH 6.0～7.5的一類蛋白酶[1],作為最先發(fā)現(xiàn)并使用的酶制劑[2],其具有作用底物廣泛、高效專一、污染小等特點,已經(jīng)廣泛應用于食品工業(yè)、飼料加工、紡織、醫(yī)藥等方面[3-5]?？莶菅堪麠U菌(Bacillussubtilis)是美國食品藥物管理局公布的安全菌種[3],是常用的中性蛋白酶生產(chǎn)菌種。益生菌是一種能夠黏附在宿主體內(nèi)來提高其健康程度的活性微生物,常見益生菌有乳桿菌、枯草桿菌等[6]。FAO/WHO《食品益生菌評價指南》中指出,益生菌必須能夠在胃腸道有效地發(fā)揮作用,其功能性評價主要包括耐酸和耐膽鹽、黏附和定植、有效生物活性及良好生產(chǎn)性能等[7]?？莶菅堪麠U菌作為很好的食品級益生菌菌株[8-9],在改善腸道菌群、調(diào)節(jié)免疫力、改善脂類代謝等方面都有廣泛應用[10],它是農(nóng)業(yè)部公布的16種可以直接飼喂動物的飼料級益生菌菌種之一[11]?？莶菅堪麠U菌能在動物腸道中生長,有利于腸道正常菌群的繁殖,并有效抑制致病菌的生長,其代謝產(chǎn)物能調(diào)節(jié)宿主腸道內(nèi)微生物菌群的平衡,對宿主有益、無害、無致病性[12]。

在工業(yè)化生產(chǎn)過程中,由于菌種的衰退,菌種產(chǎn)酶能力下降、穩(wěn)定性降低,加之原材料價格上漲,行業(yè)企業(yè)競爭等,微生物遺傳改良菌種對提高中性蛋白酶酶活力具有重要的現(xiàn)實意義。誘變包括物理誘變、化學誘變和生物誘變。紫外作為一種傳統(tǒng)的誘變技術(shù),具有操作方便、節(jié)約成本、誘變效果好等優(yōu)點。牛春華等[13]通過初篩和紫外誘變篩選得到正突變枯草芽胞桿菌菌株B4-56,其透明圈與菌落直徑比值為5.52,較原始菌株的3.01明顯增大,產(chǎn)蛋白酶能力顯著提高。王曉云等[14]利用紫外誘變獲得1株高活性蛋白酶枯草芽胞桿菌B38,蛋白酶活力為 86.82 U/mL,是出發(fā)菌株BC2的3.14倍。LiCl作為一種高效低毒的化學誘變劑,被廣泛應用于赤靈芝[15]、蛹蟲草[16]、3-羥基丙酸產(chǎn)生菌[17]、植酸酶高產(chǎn)菌株[18]等多種微生物優(yōu)良菌株的選育。復合誘變具有協(xié)同效應,其誘變效果要好于單一誘變[19]。紫外與化學誘變劑的復合誘變成功應用于產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌[20]、中性蛋白酶高產(chǎn)菌株[21]、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶高產(chǎn)菌株[22]、產(chǎn)低溫彈性蛋白酶菌株[23]、中性植酸酶高產(chǎn)菌株[24]、紅霉素高產(chǎn)菌株[25]等菌種的選育。

本研究從實驗室保藏的枯草芽胞桿菌中挑選出中性蛋白酶酶活力較高的菌株,以此菌株為出發(fā)菌株,通過紫外、LiCl、紫外-LiCl等方式來提高該菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的能力,并模擬動物體外胃腸道環(huán)境,測定高產(chǎn)菌株的耐熱、表面特性、降脂能力和對幾種致病菌的抑菌能力,并以此評價其益生特性,以期為進一步利用該菌株開發(fā)微生態(tài)制劑奠定一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽胞桿菌WT、大腸桿菌(Escherichiacoli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)保藏于微生物遺傳育種實驗室。

甘油三酯測定試劑盒、膽固醇測定試劑盒,長春匯力生物技術(shù)有限公司；L-酪氨酸、酪蛋白、膽固醇、無水氯化鋰、福林酚等,均為國產(chǎn)分析純；脫脂高鈣奶粉食品級,雙城雀巢有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：脫脂奶粉 15 g,牛肉浸膏 3 g,瓊脂粉 20 g,NaCl 5 g,蛋白胨 10 g。蒸餾水1 000 mL,pH 7.2,121 ℃滅菌20 min備用。

種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：胰蛋白胨10 g,酵母浸膏5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2,121 ℃滅菌20 min備用。添加瓊脂(15 g/L)制成試管斜面培養(yǎng)基。

LB半固體培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基中加7.5 g/L瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 30 g,D-無水葡萄糖 60 g,NaCl 10 g,CaCl22.7 g,Na2HPO44 g,pH 7蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min備用。

膽固醇培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入0.1 g/L膽固醇,0.1 g/L蔗糖酯,體積分數(shù)0.1%Tween-80,體積分數(shù)0.5%冰乙酸,2 g/L巰基乙酸鈉,pH 6.0,121 ℃滅菌15 min。

甘油三酯培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入體積分數(shù)5% Tween-80和1%豬油,2 g/L巰基乙酸鈉,pH 6.0,121 ℃滅菌15 min。

1.3 儀器與設(shè)備

SynergyHI酶標儀,美國Biotek 公司；TU-19紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司；PB-20型pH計,德國Sartarius公司；64RL高速冷凍離心機,美國Beckeman公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 中性蛋白酶酶活力的測定

依據(jù)GB/T 23537—2009《蛋白酶制劑》,利用福林-酚法測定酶活力[26]。中性蛋白酶活力定義：1 mL酶液在40 ℃,pH 7.5條件下,酪蛋白水解1 min產(chǎn)生1 μg 酪氨酸為1個活力單位,用U/mL表示。酶活力根據(jù)公式(1)計算：

(1)

式中：A,樣品OD值；K,吸光常數(shù)；V1,試劑的總體積；t,反應時間；V2,粗酶液的體積；N,稀釋總倍數(shù)。

1.4.2 紫外誘變

在超凈工作臺中,通過固定紫外燈的功率18 W和照射距離30 cm,改變紫外照射時間來得到不同的劑量。以未經(jīng)紫外照射的菌液做對照計算致死率。37 ℃避光培養(yǎng)24 h,待菌落長出后,取出平板進行計數(shù),按照公式(2)計算致死率：

(2)

式中：n0,未照射平板的菌落數(shù)；n1,照射平板的菌落數(shù)。

1.4.3 LiCl誘變

將紫外誘變選育得到的高產(chǎn)中性蛋白酶菌株活化24 h,然后取2 mL菌液到50 mL種子液中,培養(yǎng)12 h,再吸取0.1 mL活化了12 h稀釋至10-7,10-8梯度的菌懸液至不同濃度的 LiCl(0、0.3%、0.6%、0.9%、1.5%、2.1%、2.4%和2.7%質(zhì)量分數(shù),下同)脫脂奶粉固體分離平板上涂布,37 ℃,培養(yǎng)24 h,計數(shù)并計算致死率。

1.4.4 紫外-LiCl復合誘變

將篩選得到的中性蛋白酶酶活力較高的菌株,先按照1.4.3進行紫外誘變,再把紫外誘變后的菌懸液涂布于含0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.5%、2.1%、2.4%和2.7% LiCl的誘變篩選培養(yǎng)基平板上,進行復合誘變。

1.4.5 突變菌株的篩選

在最佳誘變劑量下對菌懸液進行誘變,稀釋涂布于篩選平板上,37 ℃培養(yǎng)24～60 h,記錄培養(yǎng)期間水解圈直徑H(mm)與菌落直徑C(mm),初篩標準為C在 2.0～3.5 mm 且H/C較大。初篩得到的單菌落于斜面?zhèn)鞔?活化種子液按 5%(體積分數(shù))接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,37 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng) 72 h,發(fā)酵液12 000 r/min 離心 5 min,取上清液測定中性蛋白酶的酶活力進行復篩。

1.4.6 遺傳穩(wěn)定性實驗

將篩選得到的高產(chǎn)菌株進行傳代培養(yǎng),連續(xù)傳10代,分別檢測每代菌株中性蛋白酶酶活力,以考察突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.4.7 高產(chǎn)菌株的益生特性

1.4.7.1 耐熱性

用若干無菌離心管各裝取1 mL剛活化好的高產(chǎn)菌株的發(fā)酵液,同時放入80 ℃水浴鍋恒溫水浴10 min殺死活菌后,以3 000 r/min離心10 min,取上清液分別放在 60、70、80和90 ℃不同溫度的水浴鍋中加熱10 min,冷卻至室溫后,梯度稀釋進行菌落計數(shù),按照公式(3)計算其存活率：

存活率/%=NT/No×100

(3)

式中：NT,用不同溫度處理的活菌數(shù)；No,37 ℃處理的活菌數(shù)(對照)。

1.4.7.2 耐模擬胃腸液能力的測定[27]

耐模擬胃腸液實驗：以5%的接種量將剛活化好的高產(chǎn)菌株種子液,分別接入現(xiàn)配的50 mL模擬胃液和腸液中,在37 ℃,150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng),分時間段于0、1、2、3 h取出發(fā)酵液,模擬胃液、腸液梯度稀釋并涂布,進行菌落計數(shù),以0 h為對照,按照公式(4)計算每個時間段的存活率：

存活率/%=Nt/No×100

(4)

式中：Nt,不同時間段的活菌數(shù)；No,0 h的活菌數(shù),對照。

1.4.7.3 表面凝集性

表面凝集性按照文獻[28]進行。菌體凝集性C按公式(5)計算：

(5)

式中：Ai,菌懸液初始吸光度;At,菌懸液靜置后吸光度。

1.4.7.4 表面疏水性

采用碳烴化合物法[28]。

1.4.7.5 對膽固醇、甘油三酯的降解特性

按照李文等[29]的膽固醇、甘油三酯降解率測定方法進行。

1.4.7.6 抑菌特性分析

將指示菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、120 r/min培養(yǎng)12 h,使其達到對數(shù)生長期后備用。采用牛津杯法,測定枯草芽孢桿菌UL-191發(fā)酵液的抑菌活性。將3 種指示菌分別用LB半固體培養(yǎng)基稀釋至濃度為106～107CFU/mL,倒平板。凝固后,把滅過菌的牛津杯放在瓊脂表面上。設(shè)置2組樣品：(1)枯草芽孢桿菌發(fā)酵上清液；(2)空白培養(yǎng)基。以上2組樣液均用無菌微孔0.22 μm濾膜除菌,分別吸取200 μL加到牛津杯中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,觀察并測量抑菌圈直徑。

1.4.8 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均是3 次重復結(jié)果的平均值,數(shù)據(jù)以x±s表示,利用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用Duncan’s ANOVA進行多重比較,P<0.05,差異顯著；P<0.01,差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)中性蛋白酶菌株的誘變選育

在最佳紫外線照射時間240 s,LiCl最佳濃度2.1%條件下,對出發(fā)菌株WT進行紫外、LiCl和紫外-LiCl多輪誘變,通過脫脂奶粉水解圈H/C比值初篩,液態(tài)發(fā)酵后測定中性蛋白酶酶活力復篩,篩選出高產(chǎn)中性蛋白酶菌株15株,其酶活力測定結(jié)果如圖1 所示。

圖1 誘變菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)中性蛋白酶的篩選結(jié)果Fig.1 The screening results of neutral protease by mutant strains treated with UV,LiCl and UV-LiCl 注：*表示與出發(fā)菌株WT相比有顯著差異(P<0.05), **表示與出發(fā)菌株WT相比有極顯著差異(P<0.01)

由圖1可知,經(jīng)過第1輪紫外誘變,獲得了4 株中性蛋白酶酶活力顯著高于出發(fā)菌株WT(P<0.05)的突變株,其中產(chǎn)中性蛋白酶能力最強的菌株為U-16,酶活力為82.280 U/mL,比出發(fā)菌株酶活力提高了9.6%。因此,把菌株U-16作為第2輪LiCl誘變的起始菌株。在LiCl誘變菌株中,篩選得到7株中性蛋白酶酶活力極顯著高于出發(fā)菌株WT(P<0.01)的突變株,其中L-49酶活力最高為95.612 U/mL,比出發(fā)菌株酶活力提高了17.2%。以L-49作為紫外-LiCl復合誘變的出發(fā)菌株,復合誘變菌株中,選育得到4株中性蛋白酶酶活力顯著高于紫外、LiCl誘變得到的突變菌株,其中UL-191酶活力最高,為108.812 U/mL,較菌株L-49提高了13.1%,與起始菌株WT相比提高了44.2%。

2.2 遺傳穩(wěn)定性

將復合誘變所得中性蛋白酶產(chǎn)量最高的突變株 UL-191連續(xù)傳代10次,測定每一代中性蛋白酶酶活力,結(jié)果如圖2,每代菌株的蛋白酶活力間無顯著性差異(P>0.05),即傳代次數(shù)對中性蛋白酶酶活力無顯著影響,說明該高產(chǎn)菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

圖2 突變株 UL-191 遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of mutant strain UL-191 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 菌株的耐熱性

益生菌制劑在制料過程中需要承受一定高溫,因此枯草芽孢桿菌想要作為微生態(tài)制劑就需要對高溫有一定耐受性。將菌株UL-191菌懸液于60、70、80和90 ℃ 這4種不同溫度的水浴鍋中放置10 min,以未處理作為對照,計算存活率,結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對菌株活菌數(shù)和存活率的影響Fig.3 Effect of temperature on viable count and survival rate of the strain 注：相同柱形上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

由圖3可知,以37 ℃菌株的存活率為100%,菌株經(jīng)60 ℃處理過后的芽孢存活率極高,高達368%,活菌數(shù)可達6.48 lg CFU/mL,因為芽孢在60 ℃會有一個復蘇期。經(jīng)70、80和90 ℃處理的芽孢存活率都低于100%,并隨溫度升高存活率有所下降。菌株經(jīng)70 ℃處理后的存活率為90.79%,活菌數(shù)為5.74 lg CFU/mL;80 ℃以后,隨著溫度繼續(xù)升高,存活率變化不顯著(P>0.05)?？傮w來說,菌株UL-191具有較好的耐熱性。

2.4 菌株的耐模擬胃腸液能力

食入的益生菌都要經(jīng)過胃、腸，當食團進入胃時，胃液pH會降至2～3，過低的pH會使微生物在胃液中不能存活,膽鹽對微生物生長繁殖具有明顯抑制作用，只有在較高膽鹽含量中保持活力并能夠繁殖的菌株才能抵抗住腸道消化作用而存活[30]。因此本實驗配制模擬胃液和腸液,并分別探究菌株UL-191在其中培養(yǎng)0、1、2、3 h的活菌總數(shù)及存活率,結(jié)果如圖4所示。

a-模擬胃液；b-模擬腸液圖4 模擬胃腸液對菌株活菌數(shù)和存活率的影響Fig.4 Effect of simulated gastric and intestinal fluid on viable count and survival rate of the strain

由圖4可知,隨著時間的延長,UL-191的存活率呈現(xiàn)下降趨勢,經(jīng)過模擬胃液作用3 h后活菌數(shù)略有下降,但存活率仍都能保持在78.23%以上,活菌數(shù)由7.31 lg CFU/mL降至7.20 lg CFU/mL。隨著在模擬腸液中培養(yǎng)時間的延長,存活率也呈逐漸下降的趨勢,經(jīng)過模擬腸液作用3 h后,存活率降至60.00%,活菌數(shù)由6.49 lg CFU/mL降至6.27 lg CFU/mL。菌株在模擬胃腸液中存活率均在60%以上,表明該菌株對模擬胃液和腸液都具有良好的耐受性。

2.5 菌株的表面性質(zhì)

菌株能否在腸道中發(fā)揮益生作用,關(guān)鍵在于能否在腸道中吸附定植,如果能被輕易沖掉,那么菌株的益生作用就表現(xiàn)得微乎其微,因此菌株表面特性十分重要。益生菌能夠發(fā)揮作用的前提是確保菌株能夠通過黏附作用定植于消化道內(nèi)。通過測量菌株的表面疏水性和凝集特性來評估菌株的表面特性,突變株 UL-191的表面凝集性為69.38%,以二甲苯作為有機溶劑時,其表面疏水性為46.02%,以正己烷作為有機溶劑時,其表面疏水性為31.41%,能夠較好地定植于消化道表面并進行生長繁殖,發(fā)揮益生作用。

2.6 菌株的降脂能力

甘油三酯是動物的主要能量來源,為身體提供能量。過量攝入甜食和主食會導致甘油三酯含量增加。膽固醇主要用于合成細胞,包括性腺激素在內(nèi)的許多激素,也依賴膽固醇來合成。同時,膽固醇也能促進膽汁酸的消化,但如果血清中膽固醇過多,很容易積聚在血管壁上,長時間會形成斑塊,更有甚者會導致血栓,危及生命?？莶菅挎邨U菌能否作為全面有效的益生菌制劑,其降脂能力也十分重要。將UL-191在膽固醇培養(yǎng)基和甘油三酯培養(yǎng)基中培養(yǎng),并測其在0和48 h發(fā)酵液中膽固醇和甘油三酯濃度,其結(jié)果如表1所示。

表1 降膽固醇、甘油三酯能力 單位：mmol/L

0 h時,膽固醇、甘油三酯濃度分別為0.77、4.28 mmol/L；經(jīng)枯草芽孢桿菌UL-191發(fā)酵48 h后,濃度分別降為0.50、2.18 mmol/L,降解率分別為35.00%和49.12%。由此可見,此菌株具備降解這2種物質(zhì)的能力。

2.7 菌株的抑菌活性

通過研究突變菌株UL-191對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用所形成的抑菌圈直徑大小來評估益生菌對體內(nèi)致病菌感染的預防和抑制能力。突變菌株UL-191發(fā)酵上清液加入到以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌為指示菌的LB半固體培養(yǎng)基上,以空白培養(yǎng)基作對照,實驗結(jié)果如表2所示。突變菌株UL-191發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑均大于14.00 mm,說明菌株對3 種致病菌具有較好的抑制作用,菌株對金黃色葡萄球菌抑制效果最為明顯,抑菌圈直徑為23.40 mm,其次為鼠傷寒沙門氏菌,抑菌圈直徑為17.52 mm,對大腸桿菌也有一定的抑制作用,抑菌圈直徑為14.90 mm。

表2 菌株對致病菌的抑菌活性Table 2 Inhibitory activities of the strain UL-191 against various pathogens

3 結(jié)論與討論

枯草芽孢桿菌所產(chǎn)中性蛋白酶已經(jīng)被廣泛應用于食品、釀造、醫(yī)藥等行業(yè)。紫外線作為一種簡便、快捷的誘變方法,已被用于高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的選育[13-14]。相比單一誘變方法,復合誘變能顯著改善菌株對誘變劑的敏感程度,提高正突變率。本實驗以野生型中性蛋白酶產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌WT為出發(fā)菌株,通過紫外、LiCl和紫外-LiCl多輪復合誘變,以不溶性脫脂奶粉篩選平板進行初篩,水解圈直徑H與菌落直徑C比值大小作為篩選標準,以液體發(fā)酵培養(yǎng)進行復篩,最終選育出高產(chǎn)中性蛋白酶枯草芽孢桿菌突變菌株15株,其中UL-191產(chǎn)中性蛋白酶酶活力最高,高達108.812 U/mL,較原始菌株WT提高了44.2%,比單獨紫外、LiCl誘變分別提高了32.3%、13.1%,也高于王曉云等[14]紫外誘變選育得到的枯草芽孢桿菌的蛋白酶酶活力(86.82 U/mL)。經(jīng)過10代斜面?zhèn)鞔?該菌株表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。由此可見,紫外-LiCl復合誘變可發(fā)揮紫外與LiCl的協(xié)調(diào)誘變效應,顯著提高了正突變率,明顯好于單一誘變劑的誘變效果。

當動物攝入益生菌或益生菌產(chǎn)品后,益生菌本身需要克服體內(nèi)環(huán)境影響才能發(fā)揮其正常的益生效果。動物胃中含有胃酸,腸液中含有膽鹽,想讓益生菌在動物體內(nèi)發(fā)揮作用,就必須保證其在到達腸胃的過程中不被動物體內(nèi)的胃酸和膽鹽致死[9]。本研究通過模擬胃腸液環(huán)境,突變菌株枯草芽孢桿菌UL-191連續(xù)在模擬胃、腸液中培養(yǎng)3 h后,其存活率分別在78.23%、60.00%以上,說明菌株對模擬胃腸液具有良好的耐受性,能以較高的存活率通過胃腸道。枯草芽孢桿菌要發(fā)揮其益生作用,必須先定植在細胞上,經(jīng)測定,枯草芽孢桿菌UL-191表面凝集性為69.38%,以二甲苯作為有機溶劑時,其表面疏水性為46.02%,以正己烷作為有機溶劑時,其表面疏水性為31.41%,UL-191能夠較好地定植于消化道表面并進行生長繁殖,發(fā)揮益生作用。影響益生菌表面疏水性與凝集性的因素較多,不同菌株間存在一定差異。UL-191顯示出對3種腸道致病菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌)有較好的抑制能力,對膽固醇和甘油三酯都有良好的降解能力,分別達到35.00%、49.12%,說明菌株具備降解這2種物質(zhì)的能力。綜上所述,枯草芽孢桿菌UL-191具備高產(chǎn)中性蛋白酶的能力,同時又兼具較好的益生特性,因此,該菌株在食品、飼料等行業(yè)中具備一定的應用潛力。