邵婉,王芮,周宇芳,相興偉,,孫繼鵬,王家星,廖妙飛,鄧尚貴,鄭斌*

1(浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江 舟山,316021) 2(浙江省海洋開發(fā)研究院,浙江 舟山,316021) 3(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州,310014)

氧化應(yīng)激是由于生物系統(tǒng)中自由基的增加而發(fā)生的。在正常情況下,需氧生物通過組織良好的酶和非酶的自我防御系統(tǒng)來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[1]。然而,由于自由基的過度表達(dá),機(jī)體的抗氧化能力降低,細(xì)胞分子受損,最終導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[2]。對細(xì)胞系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害的自由基大部分是氧自由基,通常稱為活性氧(reactive oxygen species,ROS)。它們的普遍存在源自不平衡的氧穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[3]。H2O2是造成氧化損傷的主要因素之一,它與誘導(dǎo)內(nèi)源性氧化應(yīng)激有關(guān),從而導(dǎo)致細(xì)胞的致癌、突變和細(xì)胞毒性[4]。

近年來,研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞是研究抗氧化的合適模型。有研究表明,一些細(xì)菌的毒性是由于它們能夠通過刺激ROS的產(chǎn)生觸發(fā)活化巨噬細(xì)胞的死亡[5]。過量的ROS很容易轉(zhuǎn)化為H2O2,并通過血紅素催化的Fenton反應(yīng)生成活性高、毒性強(qiáng)的·OH,最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞死亡[6-7]。巨噬細(xì)胞參與宿主防御,是促氧化劑作用的主要靶點(diǎn),在識別和清除微生物病原體的宿主防御系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[7]。鑒于巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的重要性及其易受ROS影響,利用巨噬細(xì)胞作為藥物篩選模型可以為研究天然產(chǎn)物在免疫系統(tǒng)中的抗氧化作用提供直觀的科學(xué)平臺。H2O2通常用于研究巨噬細(xì)胞凋亡或氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[8]。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激時(shí),抗氧化劑可以延緩細(xì)胞損傷程度。目前,天然高效抗氧化劑的開發(fā)與應(yīng)用受到越來越多的科研人員的關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦肽(peptides fromSolenoceracrassicornisby-products，SCBP)，實(shí)驗(yàn)室自行制備，原料為舟山市越洋食品有限公司提供的紅蝦加工副產(chǎn)物蝦頭蝦殼，分子質(zhì)量：250～1 000 Da，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)：61%。

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；高糖杜爾伯科改良依格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)、澳洲胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、雙抗，美國Gibco公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒，南京建成生物工程研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)試劑，TaKaRa公司； H2O2，美國Sigma；TRIzol試劑、CCK-8試劑盒、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)抗體、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch like-ECH-associated protein 1，Keap1)抗體，上海碧云天生物有限公司。其他試劑均為國藥試劑分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(BP211D),美國Sartorius公司；pH計(jì)(PHS-3S),上海虹益儀器儀表有限公司；全自動酶標(biāo)儀(Multiskan FC),美國Thermo Scientific科技有限公司；超純水儀(AdvantageA10),美國Milli-Qplus公司；超低溫冰箱(902-ULTS),美國Thermo Scientific科技有限公司；低溫高速離心機(jī)(TG20-WS),長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；核酸蛋白定量儀(ND-2000),美國Nanodrop公司；PCR儀(My Cycler),美國Bio-Rad公司；ABI 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ViiATM7),美國Applied Biosystems公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蝦肽的制備

按料液比1∶10(g∶mL)向紅蝦原料中加入95%乙醇混合,室溫下攪拌脫脂8 h,過濾,取濾渣,45 ℃烘干,備用。按料液比1∶2(g∶mL)向?yàn)V渣中加入蒸餾水,pH調(diào)至7.2,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%堿性蛋白酶,于55 ℃下攪拌酶解5 h,90 ℃滅酶20 min,過濾取上清液。將酶解液進(jìn)行 0.5 μm 孔徑無機(jī)陶瓷膜分離。收集透過液依次通過1 000和 250 Da的超濾膜,收集透過液和截留液,得到250～1 000 Da組分,冷凍干燥,即得蝦肽。

1.3.2 試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及處理

RAW 264.7用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液于37 ℃在體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取指數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),預(yù)熱PBS洗3次,反復(fù)輕柔吹打,收集細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整細(xì)胞濃度進(jìn)行種板,用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CCK-8法測定細(xì)胞毒性

收集細(xì)胞,制成適宜濃度的細(xì)胞懸液,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù),而后用完全培養(yǎng)基稀釋到濃度為4×103/mL接種至96孔板,每孔100 μL,置于5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)12 h；待細(xì)胞充分貼壁后,分組加入不同濃度的藥物,每組設(shè)置3～6個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置空白組(不加藥物),培養(yǎng)24 h后,避光每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育1～4 h,待空白對照組達(dá)到橙黃色時(shí)結(jié)束,用酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值。細(xì)胞存活率按公式(1)計(jì)算：

細(xì)胞的存活率/%=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值×100

(1)

1.3.4 蝦肽對H2O2損傷的RAW 264.7活力的影響

用不同質(zhì)量濃度的SCBP(200、400和600 μg/mL)預(yù)處理RAW 264.7細(xì)胞24 h,溫?zé)岬腜BS洗3次。除對照組外,其他組的細(xì)胞加入包含500 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基中12 h,然后每孔加入CCK-8 10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔的OD值。

1.3.5 氧化因子測定

6孔板接種對數(shù)生長期RAW 264.7細(xì)胞密度為2.5×104/mL,孵育24 h。去培養(yǎng)基,加入含有不同濃度SCBP的培養(yǎng)基孵育24 h,然后更換至500 μmol/L H2O2處理12 h。收集培養(yǎng)基上清液測定SOD,CAT和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)的含量。

1.3.6 細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)水平的測定

6孔板接種對數(shù)生長期RAW 264.7細(xì)胞密度為2.5×104/mL,孵育24 h。去培養(yǎng)基,加入含有不同濃度SCBP的培養(yǎng)基孵育24 h,然后更換至500 μmol/L H2O2處理12 h。用1 mL PBS吹打下細(xì)胞,PBS洗3遍后轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中,加入1 mL預(yù)冷的TRIzol試劑,反復(fù)吹打裂解細(xì)胞,根據(jù)GenBank基因序列,用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物,并由上海生物工程公司合成,按TRIzol試劑法提取細(xì)胞總RNA。用核酸蛋白定量儀檢測A260/A280、A260/A230及RNA濃度,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的純度。檢測后的總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,進(jìn)行PCR反應(yīng)。熒光的采集與溶解曲線的制作按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的說明進(jìn)行。每個(gè)樣品靶基因的相對mRNA表達(dá)水平用2-ΔΔCt計(jì)算,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參。

1.3.7 Western Blotting法檢測Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)

6孔板接種對數(shù)生長期 RAW 264.7 細(xì)胞2.5×104細(xì)胞/孔,孵育24 h。去培養(yǎng)基,加入含有不同濃度SCBP的培養(yǎng)基孵育24 h,然后更換至500 μmol/L H2O2處理12 h。用1 mL PBS吹打下細(xì)胞,收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中,每管加入RIPA裂解液40 μL,吹打數(shù)次,置冰上裂解15 min。12 000 r/min、4 ℃,離心10 min,取上清液,按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行蛋白濃度測定。調(diào)整蛋白至相同濃度按比例加入蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min,12 000 r/min、4 ℃,高速離心2 min,取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后,用脫脂乳粉配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的復(fù)原乳封閉1 h,4 ℃下分別孵育Nrf2、Keap1一抗過夜,再與HRP-二抗室溫孵育2 h。使用碧云天BeyoECL Star(特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)顯影,將膜置于顯影液中,使用化學(xué)發(fā)光成像儀,觀察條帶,并拍照分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 10.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差(One-way ANOVA)多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCBP對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

為了評估SCBP對RAW 264.7細(xì)胞增殖活力的影響,使用不同濃度的SCBP對細(xì)胞進(jìn)行處理,并采用CCK-8法測定細(xì)胞的存活率。由圖1可知,ρ(SCBP)<600 μg/mL時(shí)對RAW 264.7細(xì)胞的存活率沒有影響(P>0.05),說明其對RAW 264.7細(xì)胞的代謝生長無明顯的毒性,但超過該濃度會降低細(xì)胞存活率(P>0.05)。因此,SCBP質(zhì)量濃度選擇200、400和600 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 SCBP質(zhì)量濃度對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of SCBP on the viability of RAW 264.7 cells 注：組間不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2 SCBP對H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

H2O2可直接滲入細(xì)胞膜,導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體損傷和細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。為了評估SCBP對H2O2誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果表明(圖2),僅用500 μmol/L的H2O2處理RAW 264.7細(xì)胞的存活率與對照組相比明顯降低(P<0.05),這表明H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞構(gòu)建的氧化應(yīng)激模型成功；然而用SCBP預(yù)處理的RAW 264.7細(xì)胞,與單獨(dú)用500 μmol/L H2O2處理的RAW 264.7細(xì)胞相比,細(xì)胞存活率顯著提高(P<0.05),表明SCBP對RAW 264.7細(xì)胞有明顯保護(hù)作用,能緩解H2O2對RAW 264.7細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

圖2 SCBP預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)損傷的RAW 264.7 細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of SCBP pretreatment on the viability of H2O2-induced RAW 264.7 cells

2.3 抗氧化酶的測定

SOD、CAT和GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶,能抑制自由基對細(xì)胞膜的攻擊,維持細(xì)胞健康。為檢測SCBP的抗氧化活性,研究了SCBP預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞GSH-Px、SOD和CAT水平的影響。由圖3可知,僅用500 μmol/L H2O2處理12 h后,CAT、GSH-Px和SOD水平與正常組相比均顯著降低(P<0.05),表明H2O2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶受到嚴(yán)重破壞；與單獨(dú)H2O2組作用相比,蝦肽低、中、高劑量組的SOD、CAT活力均顯著升高(P<0.05),蝦肽各劑量組的GSH-Px活力有所增高,但無顯著性關(guān)系,說明蝦肽可減少氧化應(yīng)激損傷并減輕脂質(zhì)過氧化,蝦肽高劑量組減輕H2O2對細(xì)胞損傷效果較好。

圖3 SCBP對RAW 264.7細(xì)胞的SOD(a)、GSH-Px(b)和CAT(c)水平的影響Fig.3 Effects of SCBP on the levels of SOD(a),GSH-Px(b)and CAT(c)in RAW 264.7 cells.

2.4 SCBP對GPX1/SOD1/NQO1/HO-1/Nrf2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

為研究SCBP保護(hù)氧化損傷RAW 264.7細(xì)胞的作用機(jī)制,測定了細(xì)胞內(nèi)SOD1、GPX1、Nrf2等 mRNA表達(dá)水平,結(jié)果如圖4。與空白組相比,單獨(dú)H2O2處理的細(xì)胞的SOD1、GPX1、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,蝦肽高劑量組(600 μg/mL)改善效果較好,蝦肽各劑量組細(xì)胞的SOD1、GPX1、HO-1 mRNA的表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；蝦肽中、高劑量組細(xì)胞的Nrf2、NQO1 mRNA的表達(dá)量顯著提高(P<0.05),低劑量組(200 μg/mL)沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 SCBP對RAW 264.7細(xì)胞的GPX1(a)、SOD1(b)、NQO1(c)、HO-1(d)、Nrf2(e)mRNA表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of SCBP on the mRNA expression of GPX 1(a)、SOD1 (b)、NQO1(c)、HO-1(d)、Nrf2(e)in RAW 264.7 cells.

2.5 SCBP對Keap1-Nrf2信號通路的影響

通過Western Blotting檢測Nrf2以及Keap1的蛋白表達(dá),探討SCBP抗氧化作用的分子機(jī)制。結(jié)果見圖5。與空白組相比,模型組的Nrf2的相對表達(dá)量顯著增加,而Keap1的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。不同劑量的SCBP均顯著地上調(diào)了Nrf2的表達(dá),同時(shí)使Keap1的表達(dá)降低(P<0.05),其中SCBP為600 μg/mL時(shí)較其他劑量組顯著增加Nrf2的表達(dá)量,顯著減少Keap1的表達(dá)量(P<0.05)。說明SCBP通過調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1信號通路來護(hù)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,具有劑量依賴性。

圖5 SCBP對RAW 264.7細(xì)胞Nrf2(a)和Keap1(b)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of SCBP on protein expression of Nrf2 (a) and Keap1 (b) in RAW 264.7 cells

3 結(jié)論與討論

Nrf2作為一種轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化基因的產(chǎn)生和表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。ARE是HO-1、SOD、CAT、GPx和NQO1等基因的上游啟動子區(qū)域,Nrf2通常與ARE結(jié)合,酶復(fù)合物上調(diào)了組織中內(nèi)源性抗氧化基因的表達(dá),從而維持細(xì)胞氧化和抗氧化水平的平衡[22]。研究表明HO-1等細(xì)胞內(nèi)氧化還原基因是受Nrf2-ARE信號通路調(diào)控的主要內(nèi)源性保護(hù)基因[23]。HO-1具有多種作用,HO-1的高表達(dá)可顯著降低多種炎癥反應(yīng),減少組織損傷[24]。HO-1還可以調(diào)節(jié)血管平滑肌增生,維持血小板聚集和血管張力[25]。ARE激活后可誘導(dǎo)NQO1,對氧化應(yīng)激反應(yīng)具有保護(hù)作用[26]。SOD是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶,也是細(xì)胞內(nèi)主要的自由基清除劑,具有保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基侵害的作用。SOD的水平可以反映內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)的功能[27]。Keap1-Nrf2信號通路在保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)源性和外源性應(yīng)激的影響中起著重要作用[28]。細(xì)胞質(zhì)蛋白Keap1與Nrf2相互作用并抑制其功能。在非應(yīng)激細(xì)胞中,Nrf2與其抑制蛋白Keap1形成復(fù)合物,從而使其在細(xì)胞質(zhì)中失活并被阻斷。然而,當(dāng)細(xì)胞暴露于輕度氧化應(yīng)激時(shí),Nrf2在其特定絲氨酸或蘇氨酸殘基處被磷酸化,從Keap1解離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[29]。在本研究中,不同濃度蝦肽能促進(jìn)抗氧化基因SOD1、GPX1、Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA水平表達(dá),其表達(dá)水平隨著濃度的增加而有所增強(qiáng),質(zhì)量濃度為600 μg/mL時(shí)具有較好的促進(jìn)作用。各劑量組蝦肽均能顯著增加Nrf2的蛋白表達(dá),減少Keap1的蛋白表達(dá),高劑量蝦肽效果顯著。表明蝦肽預(yù)處理可使H2O2刺激后的細(xì)胞抗氧化基因表達(dá)增加,增加Nrf2蛋白表達(dá)量,減少Keap1蛋白表達(dá)量,從而緩解氧化應(yīng)激。

綜上,蝦肽能緩解H2O2所引起的RAW 264.7細(xì)胞存活率降低,提高細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT活力,增加SOD1、GPX1、Nrf2等抗氧化基因的表達(dá)量,上調(diào)Nrf2的蛋白表達(dá),下調(diào)Keap1的蛋白表達(dá),說明蝦肽對H2O2引起的RAW264.7細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用,與Nrf2/Keap1信號通路的激活有關(guān),為開發(fā)天然抗氧化劑奠定了基礎(chǔ)。