馮琳,常明,唐年初

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

枸杞(Lyciumbarbarum),又稱枸杞子、紅耳墜,為茄科枸杞屬,是一種 “藥食同源”的植物性保健食品[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究充分表明,枸杞多糖、β-胡蘿卜素、甜菜堿、?；撬?、黃酮是枸杞中重要的有效活性成分[2],具有較強(qiáng)的生理活性、細(xì)胞保護(hù)作用和免疫活性,對抗腫瘤、保肝、降壓、降血糖、抗衰老具有一定功效[3]。近年來,關(guān)于枸杞的研究主要集中在枸杞深加工[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]和抗衰老等功效研究以及發(fā)酵過程中活性物質(zhì)的變化等動態(tài)過程研究[7]。

目前,枸杞多糖能有效減輕化學(xué)毒素引起的壞死性炎癥[8]和氧化應(yīng)激[9],作為一種食品補(bǔ)充劑在預(yù)防肝臟疾病方面具有很大的應(yīng)用潛力。酒精性肝損傷已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的一大疾病[10],預(yù)防和治療酒精性肝損傷的重要機(jī)制主要為降低氧化應(yīng)激、壞死性炎癥和核轉(zhuǎn)錄因子活性從而實(shí)現(xiàn)肝臟損傷的保護(hù)作用[11],還涉及各途徑介導(dǎo)的腸道菌群失調(diào),腸屏障功能障礙等[12]。

為使得枸杞的有效成分得到利用,除對枸杞多糖、黃酮等提取加工成功能食品外,還可利用生物技術(shù)發(fā)酵這種成本較低且能廣泛應(yīng)用的深加工方式。通過控制微生物的生長,酶的釋放將枸杞中成分轉(zhuǎn)化，制備具有健康益處的飲料[13-14]。植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)使胞漿中的活性成分不易提取出來,微生物在代謝過程中會產(chǎn)生多種酶,這些酶會破壞植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)或者對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)加以修飾,使得枸杞中的活性物質(zhì)容易釋放出來[15]。發(fā)酵能產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味、香氣和質(zhì)地,也可用于食品品質(zhì)改良及風(fēng)味提升。在加工生產(chǎn)中,乳酸菌被廣泛使用,酵母菌MN0110自身能夠產(chǎn)生超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等具有強(qiáng)抗氧化性的物質(zhì),提高自由基的清除能力并緩解脂質(zhì)氧化[16]。

本研究采用乳桿菌MN1030、乳桿菌MN0727、乳桿菌MN0930和酵母菌MN0110對寧夏枸杞原漿進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,通過ADH激活率和SOD酶活力優(yōu)化各自的發(fā)酵工藝。對發(fā)酵后的枸杞酵素分別進(jìn)行對HepG2細(xì)胞酒精性損傷模型的保護(hù)作用評價。以期選擇能夠增強(qiáng)枸杞酵素解酒護(hù)肝功效的的菌種,為開發(fā)保護(hù)酒精性肝損傷的功能性食品提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

寧夏干果,寧夏潤德健康產(chǎn)業(yè)有限公司(2020年)；酪蛋白胨、牛肉膏、酵母菌MN0110粉、乙酸鈉、檸檬酸二胺、瓊脂、葡萄糖、三氯乙酸,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶50 000 U/g、果膠酶30 000 U/g、D-異抗壞血酸鈉(VC鈉)、食品添加劑,食全食美有限責(zé)任公司；酵母菌MN0110(LactobacillusMN0110)、乳桿菌MN0727(LactobacillusMN1030)、乳桿菌MN0930(LactobacillusMN0727)、乳桿菌MN1030(LactobacillusMN0930),實(shí)驗(yàn)室保藏。HepG2細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)代數(shù)為27～41代),中科院上海細(xì)胞庫。BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)細(xì)胞毒性試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)(T-SOD)、RIPA裂解液(強(qiáng)),上海碧云天生物技術(shù)有限公司；谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AL04型電子分析天平(感量0.000 1 g),梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；L12-Energy61型打漿機(jī),九陽股份有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；ZHJH-112B超凈工作臺,上海智城分析儀器有限公司；ZWY-211B恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司；Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀,賽默飛科技有限公司；Centrifuge 5415R 高速冷凍離心機(jī),艾本德股份公司(德國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

枸杞→熱燙→護(hù)色→預(yù)煮→榨汁→酶解→滅菌→冷卻→接菌→發(fā)酵→離心→酵素→清汁→調(diào)味→高壓均質(zhì)→滅菌

1.2.2 發(fā)酵菌液的制備

菌種的活化：將乳桿菌MN1030、乳桿菌MN0930、乳桿菌MN0727分別劃線接種到MRS、MC、MRS培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)48 h。

液體擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6,用無菌水洗滌2遍,調(diào)整至1×107CFU/mL。

酵母菌MN0110的活化：將酵母粉按10%的比例加入到滅菌水中,35 ℃活化30 min。

1.2.3 枸杞發(fā)酵原漿的制備工藝

將干枸杞先經(jīng)過熱燙,撈出后,枸杞以1∶4的料水比在80 ℃的水中浸提30 min,加入0.3%的Vc鈉作為護(hù)色劑,冷卻后打漿,得到漿料。采用復(fù)合酶[m(纖維素酶)∶m(果膠酶)=2∶8],酶解條件：酶解溫度40 ℃；酶解時間3 h；加酶量0.2%。

1.2.4 發(fā)酵工藝的條件優(yōu)化

1.2.4.1 枸杞酵素的單因素試驗(yàn)

調(diào)整初始pH為5.5,接種量為3%,在37 ℃下分別發(fā)酵36 h,探究不同加糖量(1%、2%、3%、4%、5%),接菌量(1%、3%、5%、7%、9%)對枸杞原漿發(fā)酵的影響,根據(jù)SOD酶活力,ADH激活率確定接菌量。分別在發(fā)酵溫度(29、33、37、41、45 ℃)下對枸杞原漿進(jìn)行發(fā)酵,對枸杞原漿進(jìn)行不同時間的發(fā)酵(12、24、36、48、60 h),根據(jù)SOD酶活力,ADH激活率確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.2.4.2 SOD酶活力和ADH激活率的測定

將以上4種枸杞酵素液先超聲波處理30 min,再于4 000 r/min離心15 min,取上清液,根據(jù)SOD酶試劑盒說明書進(jìn)行SOD酶活力的測定。根據(jù)瓦勒-霍赫(Valle &Hoch)法[17]測定ADH的激活率。SOD活性已成為抗衰老藥物和抗衰老保健食品的一個重要指標(biāo),被廣泛用作組織中抗氧化劑狀態(tài)的指標(biāo)。

1.2.5 HepG2 肝癌細(xì)胞上驗(yàn)證酒精性肝損傷的保護(hù)作用

1.2.5.1 酒精性HepG2肝細(xì)胞損傷模型的建立

按盧夢瑤[18]的方法培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%后,使用不完全培養(yǎng)基(只含0.5%的雙抗)將無水乙醇稀釋成500、600、700、800、900、1 000 mmol/L,每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT比色法)測定細(xì)胞的存活率篩選乙醇的作用濃度和作用時間[19]使用酶標(biāo)儀在570 nm下測定每孔的吸光值,細(xì)胞存活率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

在MTT法篩選出的細(xì)胞存活率為50%處選擇造模濃度范圍,每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。LDH泄露率多用來比較細(xì)胞損傷程度,以及評估藥物治療作用效果[20],采用LDH泄露率確定最終造模濃度。使用酶標(biāo)儀在490 nm下測定每個孔的吸光值,LDH泄露率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.2.5.2 枸杞酵素的細(xì)胞毒性分析

細(xì)胞培養(yǎng)條件如1.2.5.1,將以上選擇的造模濃度作用于分別培養(yǎng)3、6、12、24、36、48 h的細(xì)胞,采用MTT法研究不同的枸杞酵素在不同濃度下對HepG2的毒性作用。

1.2.5.3 細(xì)胞上清液中AST、ALT、LDH的測定

LDH用來檢測細(xì)胞膜通透性的改變,AST和ALT的釋放量能夠反應(yīng)肝細(xì)胞的受損程度。不同濃度的酵素提取液作用相同時間,選取1.2.5中最佳酒精造模濃度和時間繼續(xù)孵育相同時間。以不做任何處理的細(xì)胞組為對照組,不經(jīng)過給藥處理的但經(jīng)過酒精造模的組別作為模型組。分別檢測上清液中ALT、AST、LDH的產(chǎn)生量,并用各孔的蛋白總量進(jìn)行校正,評價不同菌種最優(yōu)發(fā)酵條件下對HepG2酒精性細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1.2.5.4 細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde,MDA)、ADH、SOD的測定

條件同1.2.5.3參照試劑盒的方法檢測細(xì)胞內(nèi)ADH激活率、MDA與SOD活力。ADH激活率一般反映細(xì)胞的解酒能力,MDA的含量反映脂質(zhì)過氧化與損傷程度,SOD水平反映對細(xì)胞過氧化表達(dá)的保護(hù)作用。

1.2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

每個樣品至少做3次平行,所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA 法),以P<0.01 表示極顯著的差異,P<0.05表示顯著性差異。圖表采用Origin 2018繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝的條件優(yōu)化

2.1.1 接菌量

在一定范圍內(nèi),不同的接菌量影響發(fā)酵酵素的產(chǎn)酸的速度,在一定范圍的pH下,菌種的生長又能受到pH的影響。此外,接種量的增多能夠縮短發(fā)酵時間或縮短延滯期。如圖1,隨著酵母菌MN0110接菌量的增加,ADH激活率逐漸增大,SOD酶活力緩慢上升后趨于不變,在5%時達(dá)到最大。乳桿菌MN0727隨著接菌量的增加,在5%接種量下ADH激活率達(dá)到最大,但SOD酶活力卻相對較小,選則3%作為接菌量。乳桿菌MN1030和乳桿菌MN0930變化趨勢一致,SOD酶活力分別于5%,3%時達(dá)到最大。綜合以上,乳桿菌MN0727、乳桿菌MN0930最優(yōu)接菌量為3%,酵母菌MN0110、乳桿菌MN103最優(yōu)接菌量為5%。

圖1 接菌量對ADH激活率和SOD酶活力的影響Fig.1 Effect of the amount of inoculation amount on ADH activation rate and SOD activity 注：不同字母不同表示同一菌種在不同加糖量之間的差異, 字母不同表明差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 發(fā)酵溫度

為了探究溫度對不同菌種發(fā)酵枸杞酵素產(chǎn)生的影響,設(shè)置不同溫度作為發(fā)酵條件(圖2)。菌種在發(fā)酵過程中溫度過低或過高,菌種生長緩慢,ADH激活率和SOD酶活力降低。因此,選擇了37 ℃作為乳桿菌MN0727和乳桿菌MN1030的最終發(fā)酵溫度,29 ℃作為酵母菌MN0110的發(fā)酵溫度,41 ℃作為乳桿菌MN0930的最終發(fā)酵溫度。

圖2 發(fā)酵溫度對ADH激活率和SOD酶活力的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on ADH activation rate and SOD activity

2.1.3 發(fā)酵時間

由圖3可知,不同種類的菌種對于ADH激活率和SOD酶活力的影響各不相同,主要是由于菌種的不同特性決定的。4種菌種除乳桿菌MN1030發(fā)酵枸杞酵素在ADH的激活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。隨著發(fā)酵時間的延長,SOD酶活均呈現(xiàn)先緩慢升高后下降的趨勢。因此,乳桿菌MN0727枸杞酵素和枸杞酵素的最佳發(fā)酵時間為36 h,乳桿菌MN1030的最優(yōu)發(fā)酵時間為48 h,乳桿菌MN0930的最優(yōu)發(fā)酵時間為24 h。

圖3 發(fā)酵時間對ADH激活率和SOD酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation time on ADH activation rate and SOD activity

2.2 HepG2 肝癌細(xì)胞上驗(yàn)證酒精性肝損傷的保護(hù)作用

2.2.1 MTT篩選造模濃度和給藥濃度

用 HepG2 細(xì)胞為模型細(xì)胞,用酒精為損傷誘導(dǎo)劑,構(gòu)建 HepG2 細(xì)胞酒精性損傷模型。利用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)(圖4),隨著酒精濃度的上升,細(xì)胞的存活率逐漸下降,在700 mmol/L時達(dá)到IC50。選取500、600、700 mmol/L濃度測定LDH泄露率。當(dāng)酒精濃度為600 mmol/L左右時,細(xì)胞存活率在50%左右,超過半數(shù)致死率,說明造模的酒精濃度給細(xì)胞造成損傷但又不至于造成細(xì)胞全部死亡,對應(yīng)的濃度為建立 HepG2 細(xì)胞酒精性損傷模型的最佳損傷濃度。

未做任何處理的細(xì)胞對照組的LDH泄露率為100%,此時,不同的造模濃度的泄露量分別為127.80%、153.21%、152.77%。酶的泄露量在600和700 mmol/L相差不多,由于后面繼續(xù)添加給藥組,時間增加24 h,可能也會給細(xì)胞帶來損傷。因此,將HepG2細(xì)胞酒精性損傷模型的造模酒精濃度設(shè)置為600 mmol/L。

a-酒精作用濃度對對HepG2細(xì)胞存活率的影響；b-造模酒精濃度對LDH泄露率的影響；c-酒精作用時間對HepG2細(xì)胞存活率的影響圖4 酒精性肝損傷造模條件Fig.4 Model conditions of alcoholic liver injury.

2.2.2 給藥濃度

由圖5可知,原漿和4個不同菌種枸杞酵素處理組在400 μg/mL以內(nèi),HepG2 細(xì)胞存活率均在90%以上,不顯示毒性作用,且各樣品組的細(xì)胞存活率相近,說明試驗(yàn)所選各樣品質(zhì)量濃度均不會影響HepG-2 細(xì)胞的正常生長,因此將400 μg/mL作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度。

圖5 不同菌種發(fā)酵枸杞酵素預(yù)處理對HepG2 細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the viability rate of HepG2 cells

2.2.3 ADH

由圖6可知,乳桿菌MN1030發(fā)酵枸杞酵素,酵母菌MN0110均可顯著提高受損細(xì)胞中的ADH活力(P<0.01)。ADH的酶活性在酒精處理后會由于細(xì)胞損傷和酒精代謝而增加。酵素組處理后,HepG2細(xì)胞中ADH活性升高,說明增強(qiáng)了酒精的代謝,防止乙醛積聚來迅速緩解乙醇誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷。

圖6 不同菌種發(fā)酵枸杞酵素預(yù)處理對酒精性肝損傷 HepG2細(xì)胞中ADH活力的影響Fig.6 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the content of ADH in HepG2 cells induced by alcohol

2.2.4 AST和ALT

ALT全部存在于細(xì)胞基質(zhì)中,AST有20%存在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,80%存在線粒體中[21]。AST,ALT是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶,主要存在細(xì)胞內(nèi),當(dāng)肝細(xì)胞受損時,細(xì)胞膜的通透性增加,酶被釋放到胞外。通過酒精性損傷細(xì)胞、AST和ALT的釋放量能夠反應(yīng)肝細(xì)胞的受損程度。炎癥和ROS的產(chǎn)生會導(dǎo)致細(xì)胞外的AST和ALT含量產(chǎn)生變化,細(xì)胞損傷程度輕,胞內(nèi)的ALT和部分AST逸出,細(xì)胞損傷程度重,線粒體內(nèi)的AST逸出。酒精的處理可能導(dǎo)致細(xì)胞膜和線粒體損傷,AST和ALT被釋放到細(xì)胞外。與模型組相比,乳桿菌MN0930發(fā)酵處理組和原漿處理組的細(xì)胞外AST含量具有一定的下降,但是沒有明顯的差異(P>0.05)。乳桿菌MN0727、酵母菌MN0110、乳桿菌MN1030組均顯著降低了細(xì)胞外的AST的含量(P<0.05)。與對照組相比,模型組ALT的含量顯著升高。較模型組,不同劑量組可顯著降低受損干細(xì)胞的ALT 的分泌量。乳桿菌MN1030與模型組差異顯著(P<0.01),且與對照組水平相近。說明乳桿菌MN1030酵素組對酒精性肝損傷有較好的干預(yù)作用。

圖7 不同菌種發(fā)酵枸杞酵素預(yù)處理對酒精性肝損傷 HepG2細(xì)胞中AST和ALT的影響Fig.7 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the content of AST and ALT in HepG2 cells induced by alcohol

2.2.5 MDA

MDA 作為生物體脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物,主要是由于炎癥因子以及ROS等造成細(xì)胞內(nèi)的氧化機(jī)制遭受到破壞,引起細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化[22]。如圖8所示,與對照組相比,模型組的MDA生成量顯著升高(P<0.01),是對照組的2.94倍。不同菌種發(fā)酵枸杞酵素單獨(dú)作用于細(xì)胞,均可顯著降低受損肝細(xì)胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生量,卻不能恢復(fù)至細(xì)胞的最初水平。對照組的MDA產(chǎn)生量在2.30 μmol/g prot,作用效果最好的酵母菌MN0110和乳桿菌MN1030能將造模組6.77 μmol/g prot分別恢復(fù)至2.46和3.81 μmol/g prot。

圖8 不同菌種發(fā)酵枸杞酵素預(yù)處理對酒精性肝損傷 HepG2細(xì)胞中MDA的影響Fig.8 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the content of MDA in HepG2 cells induced by alcohol

MDA的顯著降低說明乳桿菌MN0727和酵母菌MN0110發(fā)酵對保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化的能力要高于其他處理組。

2.2.6 SOD

SOD是細(xì)胞內(nèi)抵抗氧化應(yīng)激的主要酶系之一,是SOD、CAT、GSH-Px抗氧化酶系中最重要的一種酶[23]。圖9顯示,模型組較對照組的SOD酶活力顯著降低(P<0.01),細(xì)胞內(nèi)的抗氧化機(jī)制已經(jīng)失衡,細(xì)胞已處于氧化損傷狀態(tài)。酵素處理組較模型組SOD酶活力均有不同程度的升高,表明酵素處理組能抵御酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷,通過過量表達(dá)SOD酶來恢復(fù)HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激機(jī)制。其中酵母菌MN0110發(fā)酵處理組的SOD酶活力最高,乳桿菌MN1030、乳桿菌MN0930次之、原漿和乳桿菌MN0727最弱。與對照組差異顯著(P<0.01),說明酵素處理并不能完全抵御酒精造成的細(xì)胞損傷,但在一定程度上具有保護(hù)作用。

圖9 不同菌種發(fā)酵枸杞酵素預(yù)處理對酒精性肝損傷 HepG2細(xì)胞中SOD抗氧化酶活力的影響Fig.9 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the Intracellular SOD antioxidant enzyme activity in HepG2 cells induced by alcohol

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將乳桿菌MN1030、酵母菌MN0110、乳桿菌MN0727、乳桿菌MN0930接種于枸杞原漿進(jìn)行發(fā)酵,通過對發(fā)酵條件(接菌量、時間、溫度)進(jìn)行優(yōu)化,確定具有潛在護(hù)肝功能的枸杞酵素的最優(yōu)發(fā)酵條件。使用最優(yōu)發(fā)酵條件下不同菌種發(fā)酵的枸杞酵素作用細(xì)胞,能顯著降低造模組MDA的產(chǎn)生、AST和ALT的分泌量,顯著增加SOD酶活力和ADH 的激活率。結(jié)果表明,處理組對損傷細(xì)胞均具有保護(hù)作用,其中酵母菌MN0110和乳桿菌MN1030的保護(hù)作用最為顯著(P<0.01),未發(fā)酵原漿對損傷細(xì)胞有保護(hù)作用,但是效果不顯著(P>0.05)。酵母菌MN0110和乳桿菌MN1030發(fā)酵的枸杞酵素可從氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝方面對緩解酒精性肝損傷具有一定功效。