王俊淇,李婷婷,劉佳宜,謝晶,林洪,勵建榮*

1(渤海大學 食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧 錦州,121013) 2(大連民族大學 生命科學學院,遼寧 大連,116600) 3(上海海洋大學 食品學院,上海,201306) 4(中國海洋大學 食品學院,山東 青島,266100)

群體感應(quorum sensing,QS)是指細菌基于基因的表達,通過細胞間通訊系統(tǒng)協(xié)調細菌-細菌的相互作用和與高等生物的聯(lián)系[1]。細菌利用分泌的信號分子感應周圍環(huán)境變化,當其自身產生的信號分子分泌量或者感知外界信號分子濃度達到一定閾值時,將會引發(fā)細菌QS相關基因的表達,造成細菌某些生物行為的改變,如生物被膜的形成、毒力因子的表達等[2]。N-?；呓z氨酸內酯(acyl-homoserine lactones,AHLs)和自誘導肽2(AI-2)等小分子在細菌細胞中作為信號分子調控細菌的發(fā)病機制[3],這些信號分子也參與細菌的各種生理過程。其中,革蘭氏陰性菌主要分泌的信號分子為AI-1型信號分子。

群體感應抑制劑(quorum sensing inhibitors,QSIs)是一種能夠特異性干擾細菌細胞間通信,且不會對細菌正常生長產生抑制作用的物質。?；鄢琜4]報道了1,10癸二醇能夠作為QSI干擾殺鮭氣單胞菌的QS現(xiàn)象,同時可降低其腐敗活性。張寧[5]利用紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum026,CV026)驗證了茶多酚的QSI活性,并進一步證實了其對肺炎克雷伯菌群體感應和毒力因子的影響。丁婷等[6]報道了米曲霉源環(huán)二肽對熒光假單胞菌QS現(xiàn)象的抑制作用,并表明其作用機制可能是由于環(huán)二肽能夠結合熒光假單胞菌LuxⅠ蛋白,從而降低熒光假單胞菌的信號分子生成能力,進而導致相關基因表達量降低。與傳統(tǒng)的食品保鮮劑相比,QSIs以食品腐敗菌QS系統(tǒng)為靶點,通過干擾QS系統(tǒng)從而達到保鮮的目的。因此,利用QSIs作為食品保鮮劑是目前有效抑制食品腐敗的一種新型策略。

微生物是造成水產品腐敗的主要原因。在不同情況的水產品腐敗過程中,部分致腐能力強的微生物將會參與整個腐敗過程,這種微生物被稱作特定腐敗菌[7]。因魚類地域廣闊、品種繁多、處理方式不同等,其特定腐敗菌也不盡相同。氣單胞菌 (Aeromonasspp.) 是引發(fā)人畜共患胃腸炎和敗血癥的條件致病菌之一[8],屬于革蘭氏陰性菌,廣泛存在于海水、池塘等水生環(huán)境中[9]。同時氣單胞菌屬在生鮮魚類的貯藏過程中展現(xiàn)出致腐能力,其分泌的AHLs類信號分子具有調控毒力基因表達的能力[10]。殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)導致的疾病是虹鱒、大西洋鮭等鮭科魚類養(yǎng)殖生產過程中造成損失的主要因素之一[11]。葛陽楊等[12]研究證明殺鮭氣單胞菌具有QS現(xiàn)象,能夠通過自身分泌AHLs調控QS相關基因的表達。

脫氫乙酸鈉是一種新型的食品保鮮劑,在禽畜肉制品、水產品、果蔬類食品以及飲料中應用廣泛[13]。其性質穩(wěn)定,添加后不會對食品風味造成影響,且對人體無毒副作用。能抑制或殺死食品中的酵母菌、霉菌等微生物,從而有效延長食品貨架期[14]。雖然脫氫乙酸鈉應用廣泛,但是目前作為QSI的研究鮮有報道,故本研究以脫氫乙酸鈉作為QSI,研究其在亞抑菌濃度下對殺鮭氣單胞菌QS現(xiàn)象的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

紫色桿菌CV026是1株生物報告菌株,本身不會產生AHLs,當該菌株遇到短鏈的AHLs(C4-HSL～C8-HSL)時,會產生紫色菌素,通過這種現(xiàn)象可檢測AHLs產生。其對卡那霉素具有抗性,使用過程中應添加卡那霉素至終質量濃度為20 mg/mL。殺鮭氣單胞菌,分離自海鱸魚,上述2種菌株均由渤海大學食品科學研究院保藏。

脫氫乙酸鈉(純度99%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂,青島高科園海博生物技術有限公司；正丁醇、冰乙酸、濃硫酸、乙酸異戊酯、苯酚,天津風船化學試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、卡那霉素,國藥集團化學試劑有限公司；結晶紫,天津致遠化學試劑有限公司；脫脂奶粉,美國BD公司；瓊脂粉、蛋白胨、胰蛋白胨、D(+)-葡萄糖,北京奧博星生物技術有限責任公司；NaCl,天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司；鋅片,上海邁砷化工有限公司；AHLs信號分子(C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL),美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

W-CJ-2FD超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平,瑞士梅特勒-托利儀器有限公司；Czone系列抑菌圈測定及菌落計數(shù)儀,杭州迅數(shù)科技有限公司；Imark酶標儀,美國BIO-RAD公司；Biofuge Stratos冷凍高速離心機,美國Thermo Fisher公司；SS-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本日立公司；7890 N/5975氣相色譜-質譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫氫乙酸鈉的最小抑菌濃度測定及QS抑制效果

參照吳雅萍等[15]的方法略加修改。利用牛津杯法測定脫氫乙酸鈉的最小抑菌質量濃度。將菌種CV026和殺鮭氣單胞菌分別接種于LB肉湯中進行活化,接種比例為1∶100(體積比),28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,將活化好的菌液接種于LB營養(yǎng)瓊脂中混勻后倒板,用牛津杯打孔。待其凝固后,將不同質量濃度(1.0～5.0 mg/mL)的脫氫乙酸鈉溶液分別取200 μL加入孔中,于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h,觀察菌株的變化情況,并記錄抑菌圈直徑大小。以添加去離子水作為空白對照。

將菌種CV026以1∶100(體積比)的比例接種于LB肉湯中進行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,將活化好的菌液接種于LB營養(yǎng)瓊脂中,并添加C6-HSL信號分子混勻后倒板,待其凝固后牛津杯打孔。將不同質量濃度(0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL)的脫氫乙酸鈉溶液分別取200 μL加入孔中,置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h,觀察菌株的變化情況,并記錄抑菌圈的大小。以去離子水作為空白對照。

1.3.2 脫氫乙酸鈉對CV026紫色菌素產量的影響

參照孔凡棟等[16]的方法：將菌種CV026以體積比1∶100接種于LB肉湯中進行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,將殺鮭氣單胞菌以1∶100(體積比)的比例接種于含有終質量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL脫氫乙酸鈉的LB肉湯,并且添加C6-HSL信號分子繼續(xù)搖床培養(yǎng)。另外,設立不添加信號分子的實驗組,驗證脫氫乙酸鈉對CV026生長的影響。培養(yǎng)完成后取300 μL培養(yǎng)后的菌液于離心管,加入150 μL 100 mg/mL SDS溶液,振蕩15 s,而后加入600 μL正丁醇振蕩,提取10 s。而后于8 000 r/min離心10 min,吸取200 μL的上清液于96孔板中,并于波長595 nm下測定OD值。以去離子水為空白對照。

1.3.3 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌運動性的影響

將殺鮭氣單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中進行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。參照趙龍華等[17]的方法配制群集與泳動培養(yǎng)基,并在其中添加過濾后的脫氫乙酸鈉溶液,使其終質量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL,混勻倒板。待凝固后,取5 μL連續(xù)活化后的殺鮭氣單胞菌菌液打在含有不同質量濃度脫氫乙酸鈉的群集與泳動培養(yǎng)基上,風干后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,測量其直徑大小。分別以添加去離子水和C12-HSL為空白和陽性對照。

1.3.4 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

參照LEE等[18]的方法,將殺鮭氣單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中進行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,添加過濾后的脫氫乙酸鈉溶液使其終質量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL,繼續(xù)搖床培養(yǎng)48 h。配制牛奶瓊脂固體培養(yǎng)基并倒板,用預先滅菌的牛津杯打孔,待其凝固后,吸取200 μL上述菌液過濾于孔中。平板置于培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)過程中觀察菌株的變化情況,并測量其透明菌圈的大小。分別以添加去離子水和C12-HSL為空白和陽性對照。

1.3.5 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌生物被膜形成率的影響

參照WEI等[19]的方法,將殺鮭氣單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中進行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,添加經濾膜過濾后的脫氫乙酸鈉溶液使其終質量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL。并分裝于1.5 mL無菌離心管中,每管1 mL,每組重復3次,靜置培養(yǎng)48 h。取上清液測定菌液密度后,棄上清液,無菌水沖洗3～5次,并干燥40 min。取1 mL 1 mg/mL的結晶紫溶液染色20 min。棄結晶紫染液,用無菌水沖洗至干凈透明。用體積分數(shù)為33%的冰乙酸溶解。取200 μL溶解后的冰乙酸混合液加入96孔板測定吸光度。分別以添加去離子水和C12-HSL為空白和陽性對照。按公式(1)計算生物被膜相對形成率：

(1)

式中：OD595(處理組),脫氫乙酸鈉處理后的生物被膜的吸光度值；OD595(空白對照組),添加去離子水后的生物被膜吸光度值。

1.3.6 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌生物被膜形態(tài)的影響

參照趙朵等[20]的方法,將鋅片剪裁成邊長為10 mm的正方形,并用拋光機拋光后置于無水乙醇和去離子水中超聲清洗30 min,烘干后滅菌備用。將連續(xù)活化2次后的菌液與經濾膜過濾后的脫氫乙酸鈉溶液混合,使其終質量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL,并置于無菌培養(yǎng)皿內。將滅菌后的鋅片浸沒其中,常溫放置72 h,取出鋅片,無菌水清洗至完全除掉菌液,放入預先于冰箱中預冷體積分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液中浸泡4 h,取出鋅片后用體積分數(shù)分別為50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液進行梯度洗脫,最后經乙酸異戊酯置換2次后用無菌風干燥固定。噴金處理后利用掃描電子顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)。

1.3.7 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌AHLs產量的影響

參照孫曉佳等[21]的方法。AHLs粗提液制備：將殺鮭氣單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中進行活化,28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)活化2次后,添加脫氫乙酸鈉使其終質量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL,繼續(xù)搖床培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的菌液10 000 r/min離心15 min,取上清液。加入相同體積0.1%冰乙酸酸化后的乙酸乙酯提取液提取,并在提取液中加入一定量的無水硫酸鈉。利用旋轉蒸發(fā)儀去除溶劑,蒸發(fā)后的殘留物用1 mL甲醇進行溶解,置于-20 ℃保存。分別以添加去離子水和C12-HSL為空白和陽性對照。

GC-MS測定：以甲醇為溶劑制備6種AHLs標準品的混合溶液,通過GC-MS測定各類AHLs的保留時間,而后測定上述提取AHLs粗提液的保留時間。

2 結果與分析

2.1 脫氫乙酸鈉最小抑菌質量濃度測定及QS抑制效果

通過菌株生長情況可以觀察到脫氫乙酸鈉對CV026和殺鮭氣單胞菌的最小抑菌質量濃度為2 mg/mL。在此濃度下殺鮭氣單胞菌的生長并不會受到抑制。綜合考慮,選取亞抑菌質量濃度為1.6 mg/mL。試驗中選取脫氫乙酸鈉質量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL進行后期試驗。圖1為亞抑菌濃度下脫氫乙酸鈉對CV026產生紫色菌素的抑制作用。由圖1可知,加入脫氫乙酸鈉水溶液的處理孔周圍有白色不透明抑制圈出現(xiàn),初步表明在CV026生長沒有受到抑制的前提下,脫氫乙酸鈉能抑制CV026產生紫色菌素。這說明了脫氫乙酸鈉能干擾報告菌株CV026的QS系統(tǒng),進而影響紫色菌素的產量。

1-脫氫乙酸鈉(2 mg/mL)；2-去離子水圖1 脫氫乙酸鈉對CV026產生紫色菌素的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of sodium dehydroacetate against violacein production in CV026

2.2 脫氫乙酸鈉對CV026紫色菌素產量的影響

通過酶標法測定了不同質量濃度脫氫乙酸鈉對菌株CV026紫色菌素產量的影響(圖2)。隨著脫氫乙酸鈉質量濃度的增加,紫色菌素的產量逐漸下降,而對CV026的菌液密度幾乎沒有影響。與空白對照相比,脫氫乙酸鈉質量濃度為1.6 mg/mL時,紫色菌素的產量下降近63.39%。結果表明,在亞抑菌質量濃度下,脫氫乙酸鈉是通過干擾CV026的QS系統(tǒng)從而抑制CV026產生紫色菌素的能力。

圖2 不同質量濃度脫氫乙酸鈉對CV026產紫色菌素 和菌液密度的影響Fig.2 The effect of sodium dehydroacetate on the production of violacein and bacterial density of CV026 strain

2.3 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌運動性的影響

圖3、4表明不同質量濃度的脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌的群集和泳動的影響。隨著脫氫乙酸鈉質量濃度的增加,菌群的遷移直徑會逐漸減少?？梢耘袛鄽Ⅴq氣單胞菌的運動能力與脫氫乙酸鈉質量濃度呈負相關,當脫氫乙酸鈉終質量濃度為1.6 mg/mL時,殺鮭氣單胞菌的群集和泳動能力分別下降了82.76%和73.41%。說明在亞抑菌質量濃度情況下,殺鮭氣單胞菌的運動能力微弱。當添加C12-HSL信號分子時,殺鮭氣單胞菌遷移直徑明顯增加。渠宏雁等[22]報道了抑制劑抑制副溶血弧菌的群集與泳動的現(xiàn)象。

a-群集平板圖;b-遷移直徑 1-C12-HSL；2-去離子水；3-0.4 mg/mL； 4-0.8 mg/mL；5-1.2 mg/mL；6-1.6 mg/mL圖3 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌群集的影響Fig.3 The effect of sodium dehydroacetate on swarming motility of A.salmonicida

a-群集平板圖;b-遷移直徑 1-C12-HSL；2-去離子水；3-0.4 mg/mL；4-0.8 mg/mL； 5-1.2 mg/mL；6-1.6 mg/mL圖4 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌泳動的影響Fig.4 The effect of sodium dehydroacetate on swimming motility of A.salmonicida

2.4 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

新鮮水產品因肌肉中水分和蛋白質含量高、不飽和脂肪酸易氧化等特點,為微生物的生長繁殖提供優(yōu)良的環(huán)境,微生物則是造成水產品腐敗的主要原因。而胞外蛋白酶能快速分解魚類蛋白質導致魚類腐敗變質,周圍[23]研究表明粘質沙雷氏菌胞外蛋白酶的分泌量受到AHLs介導的QS系統(tǒng)的調控。如圖5所示,隨著脫氫乙酸鈉質量濃度的增加,胞外蛋白酶分解蛋白質產生的水解圈直徑變小。當添加外源信號分子C12-HSL時,胞外蛋白酶水解圈直徑與陰性對照組相比明顯增加。梅永超等[24]證實了綠薄荷精油對溫和氣單胞菌的胞外蛋白酶起到抑制作用。由此可以看出,殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活性是由AHLs所介導的QS系統(tǒng)影響,脫氫乙酸鈉通過干擾殺鮭氣單胞菌的QS系統(tǒng),從而抑制其胞外蛋白酶的活性。

a-牛奶平板圖;b-蛋白酶水解直徑 1-C12-HSL；2-去離子水；3-0.4 mg/mL；4-0.8 mg/mL；5-1.2 mg/mL； 6-1.6 mg/mL圖5 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶的影響Fig.5 The effect of sodium dehydroacetate on extracellular protease activity of A.salmonicida

2.5 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌生物被膜相對形成率的影響

細菌生物被膜是由附著于惰性或活性實體表面的細菌細胞和包裹細菌的水合性胞外聚合物組成的結構性細菌群落[25]。生物被膜是大多數(shù)細菌在自然狀態(tài)下的一種存在形態(tài)，這使得細菌具有更好的自我競爭優(yōu)勢。一些細菌生物被膜的形成受到其自身QS系統(tǒng)的調控,并且該系統(tǒng)所調控的多種生理行為主要依賴與群體密度影響[26]。由圖6可知,脫氫乙酸鈉對菌液密度的影響不大,但隨著脫氫乙酸鈉質量濃度升高,生物被膜的形成率反而有所下降,說明脫氫乙酸鈉能有效抑制殺鮭氣單胞菌生物被膜的形成。同時,與陰性對照相比，當添加終質量濃度為1.6 mg/mL脫氫乙酸鈉,生物被膜相對形成率僅為31.78%,而作為陽性對照添加外源信號分子C12-HSL生物被膜相對形成率達到129.37%。由此看出,脫氫乙酸鈉可能通過干擾殺鮭氣單胞菌的QS系統(tǒng)調控生物被膜的形成。

圖6 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌生物被膜相對形成率的影響Fig.6 The effect of sodium dehydroacetate on biofilm formation of A.salmonicida

2.6 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌生物被膜形態(tài)的影響

圖7是經不同質量濃度脫氫乙酸鈉處理后,殺鮭氣單胞菌形成的生物被膜的掃描電鏡圖。由圖7可知,陽性對照組中生物被膜形態(tài)結構粗糙致密,堆疊狀態(tài)加深、結構更為復雜。從圖7可知，隨著脫氫乙酸鈉的質量濃度增加,生物被膜形態(tài)破壞愈劇烈。

1-C12-HSL；2-去離子水；3-0.4 mg/mL；4-0.8 mg/mL； 5-1.2 mg/mL；6-1.6 mg/mL圖7 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌生物被膜影響的 掃描電子顯微鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopic images showing the effect of sodium dehydroacetate on biofilm formation of A.salmonicida

結果與上述酶標法測定生物被膜形成量一致,印證了脫氫乙酸鈉可顯著降低殺鮭氣單胞菌生物被膜的形成能力。ZHANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)乙醇脫氫酶可以調節(jié)不動桿菌QS現(xiàn)象,從而對生物被膜的形成造成影響。

2.7 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌AHLs產量的影響

RANI等[27]利用GC-MS測定銅綠假單胞菌AHLs信號分子的的分泌情況。圖8是6種混合AHLs(C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL)標準品的GC-MS檢測圖。6種混合標準品已經完全分離,峰形尖銳,其相應特征峰的保留時間依次為3.296、4.895、6.742、8.760、11.143、13.908 min。圖9表示殺鮭氣單胞菌所產的AHLs是C12-HSL,且在相同培養(yǎng)條件下,隨著脫氫乙酸鈉質量濃度增加,AHLs的峰面積逐漸減小,兩者呈負相關。結果表明,脫氫乙酸鈉可以有效抑制殺鮭氣單胞菌AHLs的產生。結合上文所述,證實了脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌信號分子的產生具有抑制作用。

圖8 AHLs混合標準品的GC-MS圖Fig.8 GC-MS diagram of AHLs mixed with the standard

圖9 脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌AHLs產量的影響Fig.9 The effect of sodium dehydroacetate on the production of AHLs from A.salmonicida

3 結果與討論

本文通過殺鮭氣單胞菌測定脫氫乙酸鈉的最小抑菌濃度,并利用報告菌株CV026驗證了脫氫乙酸鈉具有QS抑制性。通過QS現(xiàn)象表型如：細菌的運動性、胞外蛋白酶水解活性以及生物被膜的抑制性以及破壞作用,進一步證實在亞抑菌濃度情況下,脫氫乙酸鈉對殺鮭氣單胞菌的QS現(xiàn)象均起到抑制作用。最后,通過GC-MS進行特征峰分析抑制能力。綜上所述,脫氫乙酸鈉具有抑制殺鮭氣單胞菌自身分泌AHLs信號分子的能力,從而達到影響殺鮭氣單胞菌的QS系統(tǒng)的效果。