劉駿逸，程衛(wèi)東，李朝暉，劉曉東，彭 鵬，申 晟

[1.河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)，河南 鄭州 450000； 2.珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 珠海 519000]

根據(jù)國際糖尿病協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2015年的全球糖尿病患者總數(shù)已經(jīng)達(dá)到4.15億，到2040年預(yù)期將達(dá)到6.42億人，其中接近3/4的糖尿病患者生活在低中收入水平國家[1]。糖尿病足(diabetic foot，DF)屬于糖尿病較為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是最常見的截肢原因[2]。據(jù)估計(jì)，每年有19%～34%的糖尿病患者發(fā)生糖尿病足；約40%的糖尿病足愈合患者在1年內(nèi)潰瘍復(fù)發(fā)，60%的患者3年內(nèi)復(fù)發(fā)，65%的患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)[3]。多種因素均可導(dǎo)致糖尿病足的復(fù)發(fā)，而糖尿病足的復(fù)發(fā)將對患者的心理及生理產(chǎn)生極大的不良影響，且會(huì)增加患者關(guān)于傷口處理所產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。最近一項(xiàng)Meta分析顯示：DF患者的性別、既往DF潰瘍時(shí)長、吸煙、跖側(cè)面潰瘍、糖尿病患病時(shí)長及周圍血管病變、神經(jīng)病變均為DF發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素[5]。

DF的治療十分困難，且其預(yù)后受全身、局部、治療等多方面影響。在治療糖尿病足的過程中，中西醫(yī)結(jié)合療法具有明顯優(yōu)勢。四妙勇安湯為治療糖尿病足的代表方劑之一[6-7]，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草4味藥物組成，是治療脈管炎、脫疽熱毒熾盛證的經(jīng)典名方。方中玄參清熱涼血，瀉火解毒?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：玄參為玄參科植物玄參的根，具有舒張血管、降血糖、抗炎、抗菌、抗癌等作用，在治療DF中起到了至關(guān)重要的作用[8-9]。但是由于中草藥所含成分的多樣性，目前對于玄參治療糖尿病足的作用機(jī)制尚不完全清楚。筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，通過“疾病表型-基因-靶點(diǎn)-藥物”的模式，全方位、多角度深入研究玄參治療糖尿病足的作用機(jī)制，以期為深入研究玄參及含有玄參的中藥復(fù)方治療糖尿病足的臨床運(yùn)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 玄參的化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)的預(yù)測

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)[10]查詢。關(guān)鍵詞：玄參。限定條件：口服利用度(oral bioavailability，OB)>30%，類藥性(drug-likeness，DL)>0.18[11-12]。在數(shù)據(jù)庫中篩選出玄參的化學(xué)成分和對應(yīng)靶點(diǎn)。通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniProt)將靶點(diǎn)的名稱轉(zhuǎn)換為簡稱，將物種設(shè)置為人，對靶點(diǎn)基因和蛋白信息進(jìn)行校正，獲得標(biāo)準(zhǔn)的Symbol名稱。

1.2 獲取糖尿病足-玄參靶點(diǎn)交集

通過人類基因綜合數(shù)據(jù)庫(GeneCards)和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)查詢疾病靶點(diǎn)，以“糖尿病足”“diabetic foot”為檢索詞搜索，將搜索結(jié)果合并、規(guī)范化、去重后，與1.1項(xiàng)下的結(jié)果取交集，獲得玄參-糖尿病足靶點(diǎn)交集。

1.3 構(gòu)建玄參成分-靶點(diǎn)-糖尿病足網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape 3.7軟件中的網(wǎng)絡(luò)分析功能，調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)的顏色及度值(Degree)，獲得玄參的主要化學(xué)成分以及相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建藥物-疾病蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

在String 11.0數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，忽略孤立節(jié)點(diǎn)，選擇結(jié)合分?jǐn)?shù)>0.4的連接關(guān)系，導(dǎo)入1.2項(xiàng)下玄參-糖尿病足結(jié)果；得到玄參-糖尿病足靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，利用R語言軟件(版本4.0.2)，分析PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)后做圖。

1.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入玄參-糖尿病足交集基因，限定物種為人類，設(shè)定閾值P<0.05，進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，再將結(jié)果導(dǎo)入基迪奧生物信息云平臺(OmicShare)繪制通路信息圖。

2 結(jié) 果

2.1 玄參化學(xué)成分及對應(yīng)靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

本研究以玄參為關(guān)鍵詞，TCMSP為數(shù)據(jù)庫，OB>30%、DL>0.18為搜索條件，共得到玄參化學(xué)成分9個(gè)；檢索玄參的作用靶點(diǎn)，根據(jù)選出的化學(xué)成分篩選出對應(yīng)的靶點(diǎn)，共得到靶點(diǎn)36個(gè)。

2.2 糖尿病足相關(guān)靶點(diǎn)及玄參-糖尿病足交集靶點(diǎn)

使用關(guān)鍵詞“Diabetic foot”在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，分別得到糖尿病足的相關(guān)靶點(diǎn)4 553個(gè)和192個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共得到不重復(fù)靶點(diǎn)4 726個(gè)，與2.1項(xiàng)下結(jié)果取交集，得到玄參-糖尿病足交集靶點(diǎn)28個(gè)。

2.3 玄參-活性成分-靶點(diǎn)-糖尿病足網(wǎng)絡(luò)及分析結(jié)果

將玄參的活性成分及交集靶點(diǎn)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape數(shù)據(jù)庫，得到玄參-活性成分-靶點(diǎn)-糖尿病足網(wǎng)絡(luò)，見圖1。網(wǎng)絡(luò)中，共有34個(gè)節(jié)點(diǎn)、69條邊，藍(lán)色圓形代表活性成分，綠色長方形代表靶點(diǎn)，邊表示活性成分與靶標(biāo)之間相互聯(lián)系?；钚猿煞种蠨egree值最高者為β-谷甾醇，接下來依次是柳杉酚、玄參苷，其他類型谷甾醇如γ-谷甾醇、α1-谷甾醇，其所對應(yīng)的作用靶點(diǎn)分別為21，10，3，1個(gè)。由網(wǎng)絡(luò)可知，玄參治療糖尿病足是由多成分參與并作用于多個(gè)靶點(diǎn)的，非單一模式，其中β-谷甾醇可能是玄參治療糖尿病足的關(guān)鍵成分。

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和篩選核心靶點(diǎn)

導(dǎo)入玄參-糖尿病足的交集靶點(diǎn)至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，含有28個(gè)節(jié)點(diǎn)和84條邊，表示有28個(gè)相關(guān)蛋白參與，以及84個(gè)蛋白之間的相互作用關(guān)系。將PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape數(shù)據(jù)庫，依據(jù)蛋白的Degree值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小，Degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大。見圖2。由此可推測，玄參治療糖尿病足可能與半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3,CASP3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(Prostagrandin-endoperoxid synthase 2,PTGS2)、乙酰膽堿酯酶(A cetylcholinesterase,AChE)、JUN原癌基因(Jun Proto-oncogene,JUN)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶9(Caspase 9,CASP9)這些節(jié)點(diǎn)有關(guān)。

圖2 玄參-糖尿病足交集靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO和KEGG富集分析

利用David 6.8在線數(shù)據(jù)庫對玄參治療糖尿病足的有效作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。以P<0.05為閾值進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖3。GO富集分析包含3個(gè)部分：生物過程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)和細(xì)胞組分(Cellular component,CC)。確定了72項(xiàng)條目：其中BP部分45項(xiàng)，列出前20項(xiàng)；CC部分12項(xiàng)，列出前5項(xiàng)；MF部分15項(xiàng)，列出前5項(xiàng)。見表1。

圖3 玄參有效成分對應(yīng)靶標(biāo)的KEGG通路富集分析結(jié)果圖

表1 玄參-糖尿病足有效作用靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果

以P<0.05為閾值，共發(fā)現(xiàn)82條KEGG通路。根據(jù)P值由小到大的順序，取排名前20的通路，采用Omicshare網(wǎng)站作圖，進(jìn)行可視化展示，見圖4。其中信號傳導(dǎo)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、癌癥、感染5大類的信號通路包含的基因最多，分別包含17，14，13，12，10個(gè)基因。具體涉及通路包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、乙型肝炎、麻疹、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、EB病毒感染、1型人體免疫缺陷病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、大腸癌、細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞的腎上腺素信號傳導(dǎo)、鈣離子信號通路、凋亡-多種、鉑耐藥、p53信號通路、小細(xì)胞肺癌、唾液分泌、白細(xì)胞介素(IL)-17信號通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體(RAGE)信號通路、膽堿能突觸、乳腺癌、雌激素信號通路、血清素能突觸等，主要包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、AGE-RAGE信號通路、Ca2+信號通路、雌激素信號通路、IL-17信號通路、p53信號通路等6個(gè)通路，說明玄參可通過影響多個(gè)通路治療糖尿病足。

圖4 玄參-糖尿病足KEGG富集前20條信號通路圖

3 討 論

玄參性微寒，味苦、甘、咸，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有抗炎、抗菌、降血糖、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛等作用?！侗静菡x》曰：“玄參，稟至陰之性，專主熱病，味苦則泄降下行，故能治臟腑熱結(jié)等證。味又辛而微咸，故直走血分而通血瘀。亦能外行于經(jīng)隧，而消散熱結(jié)之癰腫。寒而不峻，潤而不膩，性情與知、柏、生地近似，而較為和緩，流弊差輕。玄參賦稟陰寒，能退邪熱，而究非滋益之品?！彼拿钣掳矞珵橹委熖悄虿∽愕拇矸絼?，其中玄參為該方的主要用藥。雖然越來越多的研究證實(shí)了玄參對糖尿病足治療的有效性[13]，但其治療機(jī)制尚未明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對玄參治療糖尿病足的機(jī)制進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：玄參治療糖尿病足的主要化學(xué)成分為β-谷甾醇，接下來依次是柳杉酚、玄參苷、谷甾醇等。既往研究表明：β-谷甾醇屬于植物甾醇，結(jié)構(gòu)與膽固醇類似；在高脂飲食和蔗糖誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠中，β-谷甾醇可通過調(diào)節(jié)IRS-1/Akt信號通路，減弱脂肪組織中的胰島素抵抗[14]。玄參苷具有在人體外周血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的能力。研究表明:玄參苷可增加靜息電位人體外周血單核細(xì)胞中Foxp3、轉(zhuǎn)化生長因子-β和IL-10 mRNA的表達(dá)，有作為消炎藥的巨大潛力[15]。目前，尚缺乏關(guān)于柳杉酚治療糖尿病足的相關(guān)研究，這為今后的實(shí)驗(yàn)研究提供了新的方向。

玄參-糖尿病足PPI網(wǎng)絡(luò)包括28個(gè)相關(guān)蛋白和84個(gè)蛋白之間的相互作用關(guān)系，其中主要靶點(diǎn)包括CASP3、DTGS2、AChE、JUN、CASP9等，這說明玄參治療糖尿病足的機(jī)制是多成分、多靶點(diǎn)的。

玄參-糖尿病足KEGG通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了82條顯著相關(guān)的通路。在所篩選出的通路中，信號傳導(dǎo)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、癌癥、感染5大類的信號通路包含的基因最多，主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鈣離子信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、雌激素信號通路。KHANAL P等[16]研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路可作為調(diào)節(jié)糖尿病蛋白的主要通路，能夠調(diào)節(jié)絕大部分降糖的蛋白。內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素抵抗是造成胰島素抵抗及2型糖尿病患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的主要原因，而下肢動(dòng)脈粥樣硬化造成肢體遠(yuǎn)端缺血、壞死、感染是糖尿病足的直接原因。研究表明：多種基因增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞中的胰島素敏感性都是依賴鈣離子信號通路的，如細(xì)胞膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)三磷酸腺苷酶1。p53是一種大小為53kD的蛋白質(zhì)，首先在腫瘤的病毒研究中被發(fā)現(xiàn)，是目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。TP53也是人類癌癥中最常見的突變基因[17]。p53蛋白不但可以限制腫瘤發(fā)展，響應(yīng)DNA損傷、缺氧、癌基因表達(dá)、營養(yǎng)剝奪及核糖體功能障礙等多種信號，而且可以控制多種生物反應(yīng)過程，如組織重塑、自噬、ROS控制，以及代謝過程等[18-20]。IL-17是一種促炎性細(xì)胞因子，與多種自身免疫性疾病有關(guān)。對自身免疫性糖尿病動(dòng)物模型和1型糖尿病患者的相關(guān)研究均提示，IL-17參與糖尿病的發(fā)病機(jī)制。IL-17可以增加炎癥反應(yīng)，加速氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。減少IL-17，可以降低血糖，提高血清胰島素。IL-17聯(lián)合鏈脲霉素會(huì)增加對胰島MIN6細(xì)胞的破壞[21]。研究[22]表明，阻斷IL-17可以減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變。糖尿病足是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為足部的潰瘍及創(chuàng)面難以愈合。AGE-RAGE信號通路是糖尿病足發(fā)生的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。AGE是多種不同中間產(chǎn)物，是縮合、重排、裂解、氧化修飾等非酶促糖基化反應(yīng)產(chǎn)物。正常人體內(nèi)的AGE含量較低，但糖尿病患者體內(nèi)AGE的生成會(huì)明顯加速。AGE的蓄積是導(dǎo)致神經(jīng)、血管等組織器官損傷的重要病理基礎(chǔ)[23-24]。已有研究表明，雌激素受體存在β細(xì)胞中，雌激素可以影響胰島β細(xì)胞中胰島素的合成與分泌，同時(shí)影響β細(xì)胞的存活和胰島素基因的表達(dá)。雌激素干預(yù)可以降低糖尿病小鼠的血糖水平，增加胰島素分泌，增強(qiáng)胰島素基因的表達(dá)[25]。

綜上所述，玄參治療糖尿病足的機(jī)制具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路等特征，相較于西藥單一作用機(jī)制更具有優(yōu)勢。玄參的主要治療成分為β-谷甾醇，作用靶點(diǎn)包括CASP3、PTGS2、AChE、JUN、CASP9，核心通路涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鈣離子信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、雌激素信號通路6個(gè)通路。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究玄參治療糖尿病足的機(jī)制僅是分子機(jī)制的預(yù)測，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制指明了方向，后期將在此研究基礎(chǔ)上開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究來驗(yàn)證其作用機(jī)制。