盧小葉 呂倩憶 李棋龍 田浩梅 張泓

〔摘要〕 目的 比較Zea-longa評分與改良Garcia評分用于針刺治療腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury， CIRI）大鼠的神經(jīng)功能缺損評估的穩(wěn)定性、準確性。方法 將60只SPF級SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、針刺組，每組20只。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型，2 h后，將線栓拔出1 cm左右，建立CIRI模型。針刺組針刺“大椎”“百會”“水溝”，每12 h進行1次，共治療7次。72 h后，分別采用Zea-longa評分與改良Garcia評分進行評價，每組選取10只大鼠行TTC染色，并測定腦梗死面積;分別分析和比較Zea-longa評分和改良Garcia評分與腦梗死面積的相關性。結果 CIRI術后，大鼠均表現(xiàn)有一定程度神經(jīng)功能的缺損癥狀，腦組織TTC染色可見腦梗死病灶。針刺治療能顯著減少腦梗死面積（P<0.05），并改善神經(jīng)功能（P<0.05，P<0.01）。相關性分析發(fā)現(xiàn)，改良Garcia評分與腦梗死面積的r值為-0.647（P<0.01），而Zea-longa評分與腦梗死面積的r值為0.575（P<0.01）;針刺與改良Garcia評分及腦梗死面積三者相關性分析r值為-0.522（P<0.05）;而針刺與Zea-longa評分及腦梗死面積r值為0.495（P<0.05）。結論 改良Garcia評分與Zea-longa評分均可用于CIRI評價研究及針刺療效評估。在對CIRI大鼠進行感覺功能相關研究時可優(yōu)先采用改良Garcia評分，偏向運動功能評估時可考慮與Zea-longa評分聯(lián)合使用，能夠比較全面地反映模型大鼠神經(jīng)功能損傷的嚴重程度和治療后的神經(jīng)功能的恢復程度。

〔關鍵詞〕 Zea-longa評分;改良Garcia評分;腦梗死面積;神經(jīng)功能;CIRI大鼠

〔中圖分類號〕R245? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.008

Evaluation Research of Zea-longa Score and Modified Garcia Score Applied to

Acupuncture Treatment of Neurological Deficits in CIRI Rats

LU Xiaoye， LV Qianyi， LI Qilong， TIAN Haomei*， ZHANG Hong*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To compare the stability and accuracy of the Zea-longa score and the modified Garcia score for the assessment of neurological deficits in rats with acupuncture treatment of cerebral ischemia reperfusion injury （CIRI）. Methods 60 SPF SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， and acupuncture group， with 20 rats in each group. The rat middle cerebral artery occlusion model was established by suture-occluded method. After 2 hours， the suture was pulled out about 1 cm to establish the CIRI model. In the acupuncture group， “Dazhui” （DU14）， “Baihui” （DU20） and “Shuigou” （DU26） were performed for 12 hours/time for a total of 7 treatments. After 72 hours， Zea-longa score and modified Garcia score were used for evaluation. 10 rats in each group were selected to perform TTC staining and measure cerebral infarction area; the correlation between Zea-longa score and modified Garcia score and cerebral infarction area was analyzed and compared. Results After CIRI， the rats all showed signs of neurological deficits to a certain degree. Cerebral infarction lesions could be seen by TTC staining of brain tissue. Acupuncture treatment can significantly reduce the area of cerebral infarction （P<0.05） and improve nerve function （P<0.05， P<0.01）. Correlation analysis found that the r value of the modified Garcia score and cerebral infarction area was -0.647 （P<0.01）， and the r value of Zea-longa score and cerebral infarction area was 0.575 （P<0.01）; the r value of the correlation analysis between acupuncture and modified Garcia score and cerebral infarction area was -0.522 （P<0.05）; while the r value of acupuncture and Zea-longa score and cerebral infarction area was 0.495 （P<0.05）. Conclusion Both the modified Garcia score and Zea-longa score can be used for CIRI evaluation research and acupuncture efficacy evaluation. When conducting sensory function-related research in CIRI rats， the modified Garcia score can be used first， and the Zea-longa score can be considered when biased in motor function assessment， but the combination of the two can more fully reflect the severity of nerve function injury in model rats and the recovery degree of nerve function after treatment.

〔Keywords〕 Zea-longa score; modified Garcia score; cerebral infarction size; neurological function; CIRI rats

缺血性腦血管病是對人類生命健康威脅最大且最主要的心腦血管疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，缺血性腦血管病占所有腦血管疾病的70%～80%[1-2]。自2014年已來，缺血性腦血管病已上升為我國人口第一大死亡原因，同時也是中國成年人日常生活活動能力下降及遺留殘疾的首要原因[3]。目前，臨床上主要通過組織恢復和再通血液灌注使腦組織恢復血供而治療。然而，有證據(jù)顯示，除急性缺血性腦卒中外，組織恢復和再通血液灌注治療不僅不能改善腦組織缺血，反而引起CIRI[4-5]，本課題組前期研究[4]已表明針刺“大椎”“百會”“水溝”可抗腦缺血再灌注損傷。

研究[5]表明，大腦中動脈阻塞是腦缺血病變最常見的部位。因此，多采用線栓法制作大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）再灌注模型進行CIRI研究。腦缺血相關指南中指出在腦缺血研究中，組織學和行為學都是評估中不可或缺的，在操作過程中應注重多個指標相結合綜合評估[6-7]。目前，大量研究CIRI模型評價方法主要包括測量梗死面積及神經(jīng)功能評分，而神經(jīng)功能評分較常用的有改良Garcia評分和Zea-longa評分，且前期研究者們均采用Zea-longa評分，近期研究者們多采用改良Garcia評分，兩者是否在評價神經(jīng)功能缺損評估方面有差異以及在針刺干預過程中于神經(jīng)缺損評估的穩(wěn)定性、準確性如何，尚未見相關研究報道。故本研究擬制作大鼠CIRI模型，針刺治療后行改良Garcia評分和Zea-longa評分，分析兩種評分與腦梗死面積、針刺干預的相關性。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

選取無特定病原體（specific pathogen free， SPF）級Sprague-Dawley（簡稱SD）大鼠60只，雄性，體質量（230±10） g。由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心代購，合格證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級動物房，室內(nèi)溫度約24～26 ℃、濕度40%～60%。每天光照12小時，自由進食、飲水。符合湖南中醫(yī)藥大學實驗動物福利和倫理委員會標準（編號：LLBH-201907230015）。

1.2? 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛（武漢賽維爾有限公司，批號：G1101）;10%水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：B1826028）;TTC溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G3004）。

水浴箱（常州金壇恒豐儀器制造有限公司，HH-W600），超低溫冰箱（中科美菱公司，DW-ZW128），單絲尼龍線栓（北京西濃科技有限公司，A4-263450）。

1.3? 分組及模型制備

實驗大鼠適應性飼養(yǎng)1周。采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠隨機分為假手術組（20只）和造模組（40只）。造模組大鼠采用MCAO再灌注進行CIRI造模。參照Zea Longa方法[8]并加以改良，10%水合氯醛按0.3 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉，仰臥位固定，備皮消毒后，選擇右側距前正中線0.3 cm處，作長約1 cm的縱行切口，用止血鉗鈍性剝離皮下筋膜、肌肉及腺體，可見頸動脈鞘，鞘內(nèi)包繞有頸總動脈（common carotid artery， CCA）和分支頸內(nèi)動脈（internal carotid artery， ICA）、頸外動脈（external carotid artery， ECA）及迷走神經(jīng)，然后鈍性剝離CCA、ICA、ECA及迷走神經(jīng)，使頸部血管、神經(jīng)充分暴露。分別在CCA、ICA、ECA上布線，靠近近心端結扎CCA、ECA，然后用動脈夾暫時將ICA夾閉。用血管剪于距CCA分支形成ICA、ECA分叉部3 mm處剪口，將尼龍線栓頭端由CCA插入至ICA，然后松開ICA處動脈夾，再繼續(xù)將線栓向內(nèi)輕輕推送，當插入深度為19 mm時（線栓上黑色標記穿過血管分叉口），將ICA遠心端細線系緊，以固定線栓防止其從CCA脫落。縫合傷口，縫合時將線栓尾端用縫合線固定于皮膚。注射青霉素抗炎，單籠飼養(yǎng)觀察。2 h后，將線栓拔出1 cm左右[9]，從而實現(xiàn)CIRI模型。生命體征平穩(wěn)后，參照Zea Longa 5分制評分法[7]，無神經(jīng)損傷為0分;提尾時對側前肢內(nèi)收屈曲為1分;爬行時向對側旋轉為2分;站立或爬行時，向對側傾倒為3分;無自主活動伴意識障礙為4分。評分在1～3分者入組。將造模成功的大鼠隨機分為模型組（20只）和針刺組（20只）。

假手術組按步驟只分離CCA、ECA及ICA，不阻斷大腦中動脈（middle cerebral artery， MCA），注射青霉素（0.2 ml/100 g）抗炎，單籠飼養(yǎng)觀察。

1.4? 干預方法

造模大鼠于麻醉清醒后（造模后120 min）進行干預。假手術組和模型組只捆綁30 min，不針刺，每12 h進行1次，共7次;針刺組根據(jù)《實驗針灸學》[10]、大鼠實驗圖譜[11]及擬人比照法定位，相關選穴如下：（1）“大椎”：第7頸椎與第1胸椎間，背部正中，直刺5 mm;（2）“百會”：頂骨正中，平刺2 mm;（3）“水溝”：唇裂鼻尖下1 mm正中處，向鼻中隔方向斜刺2 mm。行捻轉手法1 min，頻率90 次/min，15 min后捻轉1次，留針30 min，每12 h進行1次，共7次[12]。

1.5? 評價方法

72 h后分別采用Zea-longa評分法與改良Garcia評分法評價其神經(jīng)功能。

1.5.1? Zea-longa評分法? 包含0～4分，得分越高則表明神經(jīng)功能缺損越嚴重。通常1～3分者視為造模成功，納入實驗，0分及4分分別視為造模失敗、癥狀過重，予以剔除。見表1。

1.5.2? 改良Garcia評分? 主要從6個表現(xiàn)進行判斷：動物的自主運動、體態(tài)對稱性、前肢伸展運動、抓持和攀爬鐵籠能力、兩側身體觸覺反射及兩側胡須碰觸反應?？偡?8分，得分區(qū)間3～18分，得分越高，神經(jīng)功能損傷程度越輕，18分表明無神經(jīng)功能缺損。見表2。

1.6? TTC法測定腦梗死面積

假手術組、模型組、針刺組每組隨機選擇10只大鼠行TTC染色法。麻醉后斷頭取腦，-20 ℃冷凍15 min，切除小腦、嗅球，以冠狀位均勻5等分切取腦片，厚度約2 mm。立即將腦片置于0.4% TTC染液中，于37 ℃恒溫水浴鍋中避光水浴，過程中每5 min需翻面一次，確保腦片均勻染色。非梗死部位為紅色，梗死灶范圍染為灰白色。染色完畢后，將TTC染色液倒出，腦組織用4%多聚甲醛浸泡固定。6 h后，將每一腦片的尾側面用Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)進行分析，測量每一腦片的梗死面積和總面積，并計算梗死區(qū)域占全腦面積百分比。

1.7? 統(tǒng)計學分析

計量資料采用均數(shù)“x±s”表示。所有資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布者，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhanes T2或Dunnetts T3法。不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗，用中位數(shù)與四分位間距（M（Q））表示;采用Spearman等級相關系數(shù)評估相關性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 大鼠腦梗死面積比較

假手術組TTC染色無梗死灶形成。與假手術組比較，模型組與針刺組均可見不同程度的灰白色梗死灶，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，針刺組腦梗死面積明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1、表3。

2.2? Zea-longa、改良Garcia神經(jīng)功能缺損評分比較

與假手術組比較，模型組Zea-longa評分增加、改良Garcia評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），均提示CIRI大鼠神經(jīng)功能受損;治療前模型組與針刺組比較，Zea-longa評分、改良Garcia評分差異無統(tǒng)計學差異（P>0.05）;與模型組比較，針刺治療后，大鼠Zea-longa評分降低、改良Garcia評分增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）;與治療前比較，治療后針刺組大鼠Zea-longa評分降低、改良Garcia評分增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。見表4。

2.3? 兩種神經(jīng)功能評分與腦梗死面積的相關性分析

Zea-longa評分與腦梗死面積呈正相關（P<0.01）。改良Garcia評分與腦梗死面積呈負相關（P<0.01）。見表5。

2.4? 針刺與神經(jīng)功能評分和腦梗死面積的相關性分析

針刺與改良Garcia評分及腦梗死面積呈負相關（P<0.05）。針刺與Zea-longa評分及腦梗死面積呈正相關（P<0.05）。見表6。

3 討論

CIRI因其發(fā)病癥狀與中醫(yī)中風類似，故將其歸屬于中醫(yī)學“中風”范疇。調(diào)查[13]顯示，70%～80%的中風患者遺留有功能障礙，肢體運動障礙是CIRI最常見的癥狀和體征之一，當前對CIRI的相關研究也往往偏于運動功能。但中風后感覺障礙在近年逐漸被重視，有高達68%的中風患者出現(xiàn)感覺功能障礙，出現(xiàn)偏身感覺障礙的患者也達到了51%[14]，可見感覺障礙在本病中發(fā)生率極高，且對運動功能及平衡功能產(chǎn)生極大影響。Zea-longa評分法根據(jù)動物肢體活動及意識狀態(tài)進行評分，無需特殊器械，簡便且可操作性強，在動物實驗中被廣泛應用，但其主要以動物肢體運動功能為評分依據(jù)，忽視了對大鼠的感覺方面的評估。而改良Garcia評分詳細評價了受試大鼠的運動功能、感覺功能及自主活動，且采用健、患側雙側對比的方式進行評估，故目前較多研究采用改良Garcia評分。

本研究結果顯示，CIRI術后，動物均出現(xiàn)了不同程度神經(jīng)功能缺損，TTC可見腦梗死病灶，而針刺治療可顯著減少腦梗死面積（P<0.05）及神經(jīng)功能缺損評分（P<0.05，P<0.01）。相關性分析發(fā)現(xiàn)，改良Garcia評分與腦梗死面積r值為-0.647，P<0.01;而Zea-longa評分與腦梗死面積r值為0.575，P<0.01;針刺與改良Garcia評分及腦梗死面積三者相關性分析r值為-0.522，P<0.05;而針刺與Zea-longa評分及腦梗死面積r值為0.495，P<0.05;提示兩評分均可用于CIRI模型神經(jīng)功能缺損程度及針刺治療效果的評估。

綜上，改良Garcia評分與Zea-longa評分同腦梗死面積及針刺均有較高相關度。而改良Garcia評分全面評估了大鼠感覺、運動、自主活動，在對CIRI大鼠進行感覺功能相關研究時可優(yōu)先采用改良Garcia評分，偏向運動功能評估時可考慮與Zea-longa評分相結合使用，以期更準確地評估大鼠神經(jīng)功能缺損的程度及大鼠腦梗死面積。

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