李春亮 秦 鳳 齊普良 孫凱華 韓雪來 張金柱 劉延蓉 李釗偉 王 凱 李澤清

（青海省人民醫(yī)院骨科，西寧810001）

創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)退行性變、風濕性關(guān)節(jié)炎等以關(guān)節(jié)軟骨的退化變性為主要病理變化的疾病具有較高的發(fā)病率和致殘率，不僅影響患者的工作與生活，也造成了嚴重的社會負擔，成為臨床骨科工作中的重要難題［1-2］。目前常用的治療方式有保守藥物治療及人工關(guān)節(jié)置換，但存在不良反應(yīng)嚴重及假體松動、磨損等缺陷［3］。近年來組織工程學不斷發(fā)展，為骨科軟骨缺損的治療提供了新方向。人脂肪干細胞（human adipose derived stem cells，hAD?SCs）是具有多向分化潛能的干細胞，有促進組織細胞的修復(fù)和細胞再生功能，也是軟骨組織工程發(fā)展中常用的種子細胞，有取材方便、增殖能力強的特點［4］。性別決定區(qū)Y 框蛋白9（sex determining region Y box protein 9，Sox9）基因是人們發(fā)現(xiàn)的第1 個具有內(nèi)含子的Sox（sry-type HMG box）蛋白家族成員，對于促進軟骨的分化、維持軟骨細胞表型方面有重要作用［5］。研究顯示，Sox9 基因可與軟骨特異性基因中增強子元件結(jié)合，促進關(guān)節(jié)軟骨細胞再分化［6］。目前關(guān)于hADSCs 向軟骨分化的相關(guān)研究較多，但關(guān)于Sox9 基因?qū)ADSCs 向軟骨分化影響的相關(guān)研究較少。因此，本研究通過Sox9 基因過表達慢病毒液感染hADSCs，觀察對hADSCs 增殖、凋亡、成軟骨分化的影響，并探討機制，旨在為hADSCs 成軟骨分化提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 hADSCs 取自青海省人民醫(yī)院骨科膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)中廢棄脂肪。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 10%胎牛血清（南京科佰生物科技）；青-鏈霉素混合液（河北華北制藥）；含有Sox9 基因的慢病毒載體（Lenti-Sox9-EGFP）及空載體慢病毒（Lenti-EGFP）（深圳市默賽爾生物醫(yī)學科技）；辣根過氧化物酶標記IgG 抗體（廣州健侖生物科技）；Ⅱ型膠原多克隆抗體、GAP?DH 單克隆抗體（上海信帆生物科技）；轉(zhuǎn)化生長因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白 3（sekelsky mothers against dpp 3，Smad 3）抗體（上海遠慕生物科技）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（海聯(lián)邁生物工程）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)）。ELx 800 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；Biosciences FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國BD公司）；ABI 7900 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；E-Gel Imager 凝膠成像儀（美國 Invitrogen 公司）；AE31 EF-INV 倒置熒光顯微鏡（香港麥克奧迪實業(yè)集團）。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs 培養(yǎng)及鑒定［7］無菌條件下獲取脂肪組織，以胰蛋白酶消化（37℃水浴60 min），8 000/rmin離心5 min，離心半徑12.0 cm，棄去漂浮脂肪細胞和上清液，DMEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素與100 μg/ml 鏈霉素）重懸細胞，接種于培養(yǎng)皿中，密度為3.0×104個/cm2，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)，至細胞融合度達70%，按照1∶3比例傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。取第3 代細胞，PBS 重懸細胞，調(diào)整細胞密度為 1×106個/ml，分別加入 CD29、CD44、CD105 單抗和相應(yīng)同型對照抗體，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌后重懸細胞，于流式細胞儀上檢測細胞表面標志物表達情況。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 取融合度達70%細胞，消化、重懸調(diào)整密度為 1.0×107個/ml 接種于 24 孔板，每孔5 個復(fù)孔，分3 組，分別為過表達組、空載組和對照組，同條件培養(yǎng)24 h。過表達組、空載組和對照組分別加入 50 μl Lenti-Sox9-EGFP、Lenti-EGFP、無菌生理鹽水，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡下確定轉(zhuǎn)染效率>70%進行后續(xù)實驗。

1.2.3 Western blot 檢測Sox9 蛋白表達情況 取各組感染48 h 后的細胞，加入裂解液充分裂解，4℃下8 000/rmin離心5 min，離心半徑12.0 cm，收集上層清液，BCA 法檢測蛋白濃度，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 緩沖液沖洗2 遍，加入Sox9一抗（1∶1 000），4℃ 過夜，TBST 緩沖液洗膜 3 次，10 min/次，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3 次，10 min/次，加入ECL 試劑，曝光3 min，暗室中顯影，Image J軟件分析條帶灰度值，以Sox9 灰 度 值/GAPDH 灰 度 值 為 Sox9 蛋 白 相 對 表達量。

1.2.4 MTT 試驗檢測細胞增殖情況 取穩(wěn)定感染過表達組、空載組與對照組細胞，胰蛋白酶消化后接種于 96 孔板，密度為 1.0×104個/ml，每組 5 個復(fù)孔，每孔分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 時加入5 mg/ml的MTT 溶液 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，棄培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO 溶液，充分溶解后使用酶標儀檢測490 nm 波長處吸光度（A）值（A 值為活細胞數(shù)量，其值越高表示細胞增殖能力越強）。

1.2.5 Western blot 檢測培養(yǎng)不同時間 TGF-β1、Smad 3 蛋白表達情況 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組細胞，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后檢測 TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量，具體方法同1.2.3。

1.2.6 流式細胞技術(shù)檢測Sox9 過表達對hADSCs細胞凋亡的影響 收集干預(yù)48 h 的過表達組、空載組及對照組細胞，PBS 洗滌3 次后重懸，8 000 r/min離心5 min，加入預(yù)冷70%乙醇，4℃固定過夜，加入RNA 酶 100 μg/ml，37℃ 孵育 30 min，加入 5 μl An?nexin V-FITC，室溫避光15 min，加入7-氨基放射線菌素D 5 μl，1 h 內(nèi)流式細胞儀檢測，統(tǒng)計右上、下象限細胞凋亡率。

1.2.7 成軟骨誘導(dǎo)分化 取第3 代過表達組、空載組及對照組細胞，接種于24 孔板，密度調(diào)整為1.0×107個/ml，加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含高糖DMEM，1% 胎牛血清，10 μg TGF-β1，50 nmol/L 抗壞血酸，1%青鏈霉素原液，6.25 mg/L 胰島素），置于37℃、5%CO2恒溫、恒濕箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化2 周，每72 h換液1次，顯微鏡觀察。

1.2.8 甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察 甲苯胺藍染色：收集誘導(dǎo)分化2周各組細胞，加入4%多聚甲醛固定細胞，10 min 后水洗，甲苯胺藍染色15 min。Ⅱ型膠原免疫組化染色：4%多聚甲醛固定細胞，蒸餾水洗滌，0.2 U/ml 軟骨素酶ABC，37℃孵育30 min，3%H2O2甲醇去除內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗滌，5%BSA室溫作用30 min，加入Ⅱ型膠原多克隆抗體（1∶500），4℃ 孵育過夜，實施免疫組化染色。

1.2.9 Western blot 檢測誘導(dǎo)分化 2 周后 TGF-β1、Smad 3 蛋白表達情況 檢測各組誘導(dǎo)分化2 周后TGF-β1、Smad 3蛋白相對表達量，方法同1.2.3。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及處理使用SPSS 24.0，計量數(shù)據(jù)以表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hADSCs 細胞形態(tài)及鑒定 顯微鏡觀察，原代hADSCs 細胞培養(yǎng)0.5 d 貼壁生長，呈圓或橢圓形；培養(yǎng)第3 天增殖原代細胞呈纖維細胞樣生長，為束狀；培養(yǎng)第7 天，細胞增殖速度明顯增快，呈旋渦狀排列，見圖1。流式細胞技術(shù)檢測第3 代hADSCs 各表面標志物CD29、CD44、CD105 為陽性表達，表達率分別為99.82%、99.50%、98.26%。見圖2。

圖1 hADSCs形態(tài)觀察（×40）Fig.1 Morphological observation of hADSCs（×40）

圖2 流式細胞技術(shù)鑒定第3代hADSCs表面標志物Fig.2 Identification of surface markers of third genera?tion hADSCs by flow cytometry

2.2 Sox9 蛋白相對表達情況比較 感染48 h 后3 組Sox9 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），與空載組和對照組比較，過表達組Sox9蛋白相對表達量更高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001），空載組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3、表1。

表1 Sox9 蛋白相對表達情況比較（）Tab.1 Comparison of relative expression of Sox9 protein（）

表1 Sox9 蛋白相對表達情況比較（）Tab.1 Comparison of relative expression of Sox9 protein（）

Note：Compared with control group，1）P<0.001；compared with no-load group，2）P<0.001.

Relative protein expression 0.32±0.10 0.34±0.11 0.90±0.151）2）36.457<0.001 Groups Control No-load Overexpression F P

圖3 各組細胞Western blot圖Fig.3 Western blot of cells in each group

2.3 各組細胞不同時刻MTT 試驗A 值比較 3 組MTT 試驗A 值均隨時間延長而升高（P<0.001）；與對照組和空載組比較，過表達組 24、48、72 h 的 A 值更高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；對照組和空載組不同時間、組間的A值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組細胞不同時刻MTT試驗A值比較（，%）Tab.2 Comparison of MTT test A values of cells in each group at different times（，%）

表2 各組細胞不同時刻MTT試驗A值比較（，%）Tab.2 Comparison of MTT test A values of cells in each group at different times（，%）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with no-load group，2）P<0.05；compared with 24 h，3）P<0.05；compared with 48 h，4）P<0.05.

72 h 34.25±5.553）4）34.98±5.013）4）52.38±6.011）2）3）4）17.169<0.001 Groups Control No-load Overexpression F P 24 h 14.32±3.45 15.02±3.80 28.12±4.221）2）20.528<0.001 48 h 22.35±4.553）22.54±4.453）40.32±5.321）2）3）23.220<0.001

2.4 各組細胞不同時刻TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量比較 過表達組TGF-β1、Smad 3蛋白相對表達量隨時間延長而升高（P<0.05）；與空載組和對照組比較，過表達組24 h、48 h、72 h TGF-β1、Smad 3蛋白相對表達量更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對照組和空載組不同時間、組間的A值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖4、表3。

表3 各組細胞不同時刻TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量比較（）Tab.3 Comparison of the relative expression of TGF-β1 and Smad 3 protein in different time points（）

表3 各組細胞不同時刻TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量比較（）Tab.3 Comparison of the relative expression of TGF-β1 and Smad 3 protein in different time points（）

Note：Compared with control group and no-load group for 24 h，1）P<0.001；Compared with control group and no-load group for 48 h，2）P<0.001；Compared with control group and no-load group for 72 h，3）P<0.001；Compared with 24 h in overexpression group，4）P<0.001；Compared with 48 h in overexpression group，5）P<0.001.

Smad 3 0.33±0.04 0.35±0.05 0.36±0.06 0.31±0.05 0.32±0.04 0.35±0.06 0.45±0.041）0.66±0.052）4）0.88±0.083）4）5）14.164<0.001 Groups Control No-load Overexpression Time（h）24 48 72 24 48 72 24 48 72 F P TGF-β1 0.28±0.05 0.30±0.04 0.31±0.06 0.29±0.06 0.31±0.05 0.32±0.06 0.54±0.081）0.75±0.092）4）0.92±0.013）4）5）47.830<0.001

圖4 各組細胞不同時刻Western blot圖Fig.4 Western blot at different time points of each group of cells

2.5 各組細胞凋亡情況比較 對照組的凋亡率為（24.36±4.32）% ，空 載 組 的 凋 亡 率 為（23.25±4.32）%，過表達組的凋亡率為（10.33±3.19）%，3組的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=21.481，P<0.001），與對照組和空載組比較，過表達組的凋亡率 更 低（t空白組vs干預(yù)組=6.602，P<0.001；t對照組vs干預(yù)組=6.145，P<0.001），對照組與空載組的凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞凋亡情況Fig.5 Apoptosis of each group

2.6 hADSCs 成軟骨分化誘導(dǎo)結(jié)果 成軟骨誘導(dǎo)分化2周后，甲苯胺藍染色顯示過表達組hADSCs胞漿及細胞核為藍紫色，空載組和對照組為微弱淡藍色，提示Sox9 過表達后的hADSCs 有蛋白多糖表達。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色結(jié)果顯示過表達組為強陽性，Ⅱ型膠原含量顯著升高，胞漿中有較多粗大黃棕色顆粒，空載組和對照組為弱陽性。見圖6、圖7。

圖6 甲苯胺藍染色（×100）Fig.6 Toluidine blue staining（×100）

圖7 Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色（×100）Fig.7 Type Ⅱ collagen immunocytochemical staining（×100）

2.7 各組TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量比較3 組的 TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），與對照組和空載組比較，過表達組的TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），對照組與空載組蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4、圖8。

圖8 各組Western blot圖Fig.8 Western blot of each group

表4 各組TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量比較（）Tab.4 Comparison of relative expression levels of TGF-β1 and Smad 3 proteins in each group（）

表4 各組TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量比較（）Tab.4 Comparison of relative expression levels of TGF-β1 and Smad 3 proteins in each group（）

Note：Compared with control group，1）P<0.001；compared with no-load group，2）P<0.001.

Smad 3 0.42±0.13 0.40±0.12 0.80±0.151）2）14.164<0.001 Groups Control No-load Overexpression F P TGF-β1 0.32±0.10 0.35±0.11 1.01±0.161）2）47.830<0.001

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨科的常見疾病，主要由外傷、疾?。L濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等）引起［8］。因關(guān)節(jié)軟骨無血管、神經(jīng)及淋巴結(jié)組織，自身的修復(fù)能力差，在出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨病變后，若未及時得到有效的治療極易出現(xiàn)關(guān)節(jié)功能障礙，嚴重者可喪失運動功能［9］。目前軟骨組織工程學是治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的新方向，細胞介導(dǎo)的基因治療是軟骨組織工程學的重要途徑之一［10］。目的基因的選擇是影響種子細胞增殖、分化的重要條件，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）等可溶性生長因子雖具有誘導(dǎo)成軟骨細胞分化功能，但半衰期較短，效果并不滿意［11］。因此，尋求合適的修飾基因?qū)τ谲浌墙M織的修復(fù)有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，Lenti-Sox9-EGFP 感染hAD?SCs，過表達組的Sox9 蛋白相對表達量均高于空載組和對照組；與對照組和空載組比較，過表達組24 h、48 h、72 h 的 MTT 試驗 A 值更高、凋亡率更低，提示過表達Sox9 能促進hADSCs 的增殖，抑制凋亡。Sox9 擁有位于羥基端HMG 框結(jié)構(gòu)域及氨基端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，主要在軟骨細胞中表達，在軟骨的發(fā)育形成中有重要作用，可調(diào)節(jié)軟骨細胞的分化增殖、間充質(zhì)細胞的聚集、維持軟骨細胞表型，抑制軟骨細胞向肥大細胞的轉(zhuǎn)化［12］。張軍等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Sox9 轉(zhuǎn)染人臍干細胞能促進其向軟骨細胞分化，證實Sox9 對于臍干細胞的軟骨分化有較強的調(diào)控作用。趙辰等［14］研究認為，高表達的 Sox9 可抑制BMP2 誘導(dǎo)的凋亡，促進軟骨細胞的增殖分化。以上研究說明，Sox9 基因具有調(diào)控軟骨細胞增殖、凋亡的作用，結(jié)合本研究結(jié)果證實Sox9 可促進hAD?SCs的增殖，抑制凋亡。

本研究結(jié)果中過表達組24 h、48 h、72 h 的TGF-β1、Smad 3 蛋白相對表達量隨時間延長而升高；成軟骨誘導(dǎo)分化2 周后，甲苯胺藍染色顯示過表達組hADSCs 胞漿及細胞核為藍紫色，空載組和對照組為微弱淡藍色，Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色結(jié)果顯示過表達組為強陽性，過表達組的TGF-β1、Smad 3蛋白相對表達量較空載組和對照組更高，說明Sox9過表達可促進hADSCs 的增殖并可向成軟骨細胞誘導(dǎo)分化，其機制可能與上調(diào) TGF-β1、Smad 3 蛋白表達有關(guān)。Sox9 作為調(diào)控軟骨發(fā)生的主要轉(zhuǎn)錄因子，可和軟骨細胞特異基因Ⅱ型膠原共同表達，從而調(diào)控軟骨的分化［15-16］。TGF-β1 是具有多功能的多肽類生長因子，不僅有調(diào)控細胞周期、早期發(fā)育分化、細胞外基質(zhì)的形成、誘導(dǎo)細胞凋亡等作用，還有修復(fù)、促進基質(zhì)沉積，增加膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ水平，促進組織重塑的作用［17］。CHEN 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，Sox9 基因表達水平的上調(diào)可促進TGF-β1 的表達，促進關(guān)節(jié)軟骨再生。Smads 是TGF-β 下游的信號蛋白分子，直接參與TGF-β 超家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［19］。研究表明，TGF-β1 在促成骨細胞分化過程中，其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad 3 由細胞質(zhì)向細胞核轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)TGF-β1 信號，促進成骨細胞的增殖與分化［20］。因此，Sox9 促進 hADSCs 增殖與向成軟骨細胞誘導(dǎo)分化的機制與上調(diào)TGF-β1、Smad 3 的表達有關(guān)。

綜上所述，Sox9 基因過表達可促進hADSCs 的增殖，抑制其凋亡，并促進其成軟骨分化，其機制可能與上調(diào)TGF-β1、Smad 3蛋白的表達有關(guān)。在今后軟骨組織工程細胞介導(dǎo)的基因治療中，可將Sox9 作為參考修飾基因。