楊 燕 劉德智 （新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)科二區(qū)，新鄉(xiāng)453000）

膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，而血管內(nèi)皮細(xì)胞在膿毒癥發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1-2］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡最終造成細(xì)胞損傷［3-4］。目前關(guān)于膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生的分子機(jī)制尚未完全闡明，因而深入探究膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制有助于提高診斷及治療效果。長(zhǎng)鏈非編碼RNA FGD5-AS1（long non-coding RNA FGD5-AS1，LncRNA FGD5-AS1）在牙周炎中呈低表達(dá)，并可影響牙周炎發(fā)生及發(fā)展過(guò)程［5］。生物信息學(xué)分析顯示微小RNA-133a-3p（microRNA-133a-3p，miR-133a-3p）可能是 FGD5-AS1 的靶基因，研究表明miR-133a-3p 在膿毒癥患者血清中表達(dá)上調(diào)，并可能作為診斷膿毒癥的分子標(biāo)志物［6］。但FGD5-AS1 是否可通過(guò)調(diào)控miR-133a-3p 的表達(dá)從而影響膿毒癥發(fā)生及發(fā)展過(guò)程尚未可知。本研究通過(guò)LPS 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建膿毒癥模型，觀察FGD5-AS1 與miR-133a-3p 在細(xì)胞模型中的表達(dá)變化，分析其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子表達(dá)水平的影響，為揭示膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 20只清潔級(jí)SD大鼠體重200～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）：2016-0013；LPS 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司（貨號(hào)：I2880，生產(chǎn)批號(hào)：20170320）；膜聯(lián)蛋白V（An?nexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propid?ium iodide，PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司（貨號(hào)：MK1025，生產(chǎn)批號(hào)：2017-0410）；TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司；杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；Lipofectamine 2000 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司（貨號(hào)：11668，生產(chǎn)批號(hào)：20170316）；pcDNA3.1購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；miR-133a-3p寡核苷酸模擬物（miR-133a-3p mimics）及陰性對(duì)照 mimic NC 序列（miR-NC）、FGD5-AS1 小干擾 RNA（si-FGD5-AS1）、亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；甲基噻唑基四唑（me?thylthiazolyl tetrazolium，MTT）購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司（貨號(hào)：ZY111105-500，生產(chǎn)批號(hào)：20170412）；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司；RIPA、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞［7］取20只SD大鼠，麻醉后處死，將大鼠頭部置于75%酒精，切除腦組織，去除顱骨，分離腦組織，PBS洗滌，剝離軟腦膜與大血管，去除大腦蛋白質(zhì)，PBS洗滌，使用75 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，取濾網(wǎng)上的血管段，PBS 洗滌，4℃下1 500/rmin 離心8 min，加入Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫水浴鍋孵育 15 min，1 500/rmin 離心 5 min，吹打混勻，1 500/rmin離心5 min，加入DMEM完全培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)期血管內(nèi)皮細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度2×105個(gè)/ml，接種于6孔板（100 μ/l孔），使用含有10 mg/ml的LPS處理細(xì)胞24 h（LPS組），以此模擬膿毒癥環(huán)境［8］。未經(jīng)處理的細(xì)胞作為control組。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到70%時(shí)將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-FGD5-AS、pcDNA3.1-FGD5-AS1 與 miR-NC、pcDNA3.1-FGD5-AS1及miR-133a-3p轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為DMEM完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染方法與步驟參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，隨后使用含有10 mg/ml LPS 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別記作 LPS+pcDNA3.1 組、LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS 組、LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC 組、LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p組。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中FGD5-AS1、miR-133a-3p的表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度。FGD5-AS1 正向引物5'-TACAGTGCAGTGGTG?GCTTA-3'，反向引物 5'-AGGCACCCACTTATCAAGCT-3'；miR-133a-3p 正向引物 5'-CCCTTTGGTCCC-CTTCAAC-3'，反向引物5'-CAGTGCAGGGTCCGAG?GTAT-3'；GAPDH 正向引物 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；U6 正向引物 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCAC?GAATTTG-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 2 min（循環(huán) 1 次），95℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s（循環(huán)40次）。FGD5-AS1以GAPDH 為內(nèi)參，miR-133a-3p 以 U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算 FGD5-AS1、miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)期血管內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度 3×104個(gè)/ml，接種于 96 孔板（100 μ/l孔），按照1.2.2分組處理，每孔中加入20 μl MTT溶液，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值（OD490nm），計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組對(duì)數(shù)期血管內(nèi)皮細(xì)胞（1×104個(gè)/ml），預(yù)冷PBS 洗滌，4℃ 下1 000/rmin離心5 min，收集細(xì)胞，加入500 μl Binding Buffer，分別加入5 μl Annexin V-FITC 與 5 μl PI，充分混勻，室溫避光孵育20 min，應(yīng)用FACS Cali?bur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 ELISA 檢測(cè) TNF-α、IL-1、IL-6 濃度 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA 法檢測(cè)各組TNF-α、IL-1、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)FGD5-AS1的靶基因 Starbase 預(yù) 測(cè)顯示 FGD5-AS1 與 miR-133a-3p 存在結(jié)合位點(diǎn)，將含有結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)的序列片段分別插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型質(zhì)粒WT-FGD5-AS1 與突變型質(zhì)粒MUT-FGD5-AS1，分別將 WT-FGD5-AS1、MUT-FGD5-AS1 與 miR-NC、miR-133a-3p mimics 共轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，參照熒光素酶活性檢測(cè)試劑檢測(cè)各組相對(duì)熒光素酶活性。分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-FGD5-AS1、si-NC、si-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-133a-3p的表達(dá)水平。

1.2.8 Western blot檢測(cè)P21、Caspase-3蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)蛋白濃度，蛋白高溫變性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白，電泳結(jié)束后將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗稀釋液（1∶1 000），4℃ 孵育過(guò)夜，TBST洗滌，孵育，加入二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌，曝光，顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，任意兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 作用下 FGD5-AS1、miR-133a-3p 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá) 與Control 組相比，LPS 組血管內(nèi)皮細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），miR-133a-3p的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 LPS 作用下 FGD5-AS1、miR-133a-3p 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)（，n=9）Tab.1 Expression of FGD5-AS1 and miR-133a-3p in vas?cular endothelial cells under effect of LPS（，n=9）

表1 LPS 作用下 FGD5-AS1、miR-133a-3p 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)（，n=9）Tab.1 Expression of FGD5-AS1 and miR-133a-3p in vas?cular endothelial cells under effect of LPS（，n=9）

Note：Compared with control group，1）P<0.05.

miR-133a-3p 0.98±0.10 2.69±0.251）19.052<0.001 Groups Control LPS t P FGD5-AS1 1.02±0.10 0.34±0.031）19.540<0.001

2.2 過(guò)表達(dá)FGD5-AS1 對(duì)LPS 作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。與Control 組相比，LPS 組血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），P21、Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與LPS+pcDNA3.1 組相比，LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1組血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05），P21、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。

表2 過(guò)表達(dá)FGD5-AS1對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effects of overexpression of FGD5-AS1 on cell activity and apoptosis of LPS-induced vascular endothelial cells（，n=9）

表2 過(guò)表達(dá)FGD5-AS1對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effects of overexpression of FGD5-AS1 on cell activity and apoptosis of LPS-induced vascular endothelial cells（，n=9）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS+pcDNA3.1 group，2）P<0.05.

Apoptosis rate（%）8.01±1.00 26.64±2.531）27.12±2.65 13.32±1.222）209.007<0.001 Groups Control LPS LPS+pcDNA3.1 LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1 F P FGD5-AS1 1.01±0.10 0.32±0.031）0.33±0.03 0.85±0.082）249.808<0.001 P21 0.22±0.02 0.72±0.071）0.74±0.07 0.33±0.032）230.568<0.001 Caspase-3 0.34±0.03 0.86±0.091）0.90±0.09 0.41±0.042）165.738<0.001 Viability rate（%）100.26±10.15 53.58±5.421）52.97±5.40 88.14±8.432）90.197<0.001

圖1 過(guò)表達(dá)FGD5-AS1 對(duì)LPS 作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of FGD5-AS1 overexpression on LPS-in?duced apoptosis of vascular endothelial cells and ex?pressions of P21 and Caspase-3 proteins

2.3 過(guò)表達(dá)FGD5-AS1對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響 與Control 組相比，LPS 組血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6 水平顯著升高（P<0.05）；與LPS+pcDNA3.1 組相比，LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1 組血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著降低（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 過(guò)表達(dá)FGD5-AS1對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響（，n=9，pg/ml）Tab.3 Effect of overexpression of FGD5-AS1 on the expression of inflammatory factors in LPS-affected vascular endothelial cells（，n=9，pg/ml）

表3 過(guò)表達(dá)FGD5-AS1對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響（，n=9，pg/ml）Tab.3 Effect of overexpression of FGD5-AS1 on the expression of inflammatory factors in LPS-affected vascular endothelial cells（，n=9，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS+pcDNA3.1 group，2）P<0.05.

IL-6 134.56±12.67 367.38±32.341）372.15±31.68 167.82±14.852）238.660<0.001 Control LPS LPS+pcDNA3.1 LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1 F P 72.02±7.00 183.24±15.021）182.16±15.14 93.51±8.522）212.734<0.001 94.61±8.43 235.06±21.271）237.15±20.69 126.59±11.422）180.394<0.001 GroupsTNF-αIL-1

2.4 FGD5-AS1 靶向、調(diào)控 miR-133a-3p Starbase預(yù)測(cè)顯示FGD5-AS1 與miR-133a-3p 存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒 WT-FGD5-AS1 的細(xì)胞中，miR-133a-3p 組熒光素酶活性顯著低于miR-NC 組（P<0.05）；轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒MUT-FGD5-AS1的細(xì)胞中，miR-133a-3p組與miR-NC 組熒光素酶活性相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表4。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與pcD?NA3.1組相比，pcDNA3.1-FGD5-AS1組細(xì)胞中miR-133a-3p 的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與si-NC 組相比，si-FGD5-AS1 組細(xì)胞中miR-133a-3p 的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見(jiàn)表5。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）Tab.4 Double luciferase report assay（，n=9）

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）Tab.4 Double luciferase report assay（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

MUT-FGD5-AS1 1.02±0.10 0.95±0.10 1.485 0.157 Groups miR-NC miR-133a-3p t P WT-FGD5-AS1 1.00±0.10 0.22±0.021）22.946<0.001

表5 FGD5-AS1調(diào)控miR-133a-3p的表達(dá)（）Tab.5 FGD5-AS1 regulates expression of miR-133A-3p（）

表5 FGD5-AS1調(diào)控miR-133a-3p的表達(dá)（）Tab.5 FGD5-AS1 regulates expression of miR-133A-3p（）

Note：Compared with pcDNA3.1 group，1）P<0.05；compared with si-NC group，2）P<0.05.

miR-133a-3p 1.01±0.10 0.29±0.031）0.98±0.10 2.61±0.252）417.076<0.001 Groups pcDNA3.1 pcDNA3.1-FGD5-AS1 si-NC si-FGD5-AS1 n9 9 9 9 F P

圖2 FGD5-AS1靶向miR-133a-3pFig.2 FGD5-AS1 targeted miR-133-a-3p

2.5 過(guò)表達(dá)miR-133a-3p 能逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1 對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡的影響 與LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC 組 相 比，LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p 組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），P21、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖3、表6。

表6 過(guò)表達(dá)miR-133a-3p能逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡的影響（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-133a-3p can reverse effect of FGD5-AS1 on cell activity and apoptosis of LPS-affected vascu?lar endothelial cells（，n=9）

表6 過(guò)表達(dá)miR-133a-3p能逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡的影響（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-133a-3p can reverse effect of FGD5-AS1 on cell activity and apoptosis of LPS-affected vascu?lar endothelial cells（，n=9）

Note：Compared with LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）13.06±1.31 24.10±2.371）12.231<0.001 Groups LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p t P miR-133a-3p 1.03±0.10 2.28±0.231）14.952<0.001 P21 0.31±0.03 0.63±0.061）14.311<0.001 Caspase-3 0.39±0.40 0.79±0.081）13.416<0.001 Viability rate（%）88.06±8.16 55.61±5.491）9.898<0.001

圖3 過(guò)表達(dá)miR-133a-3p能逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1對(duì)LPS 作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Overexpression of miR-133a-3p reversed effect of FGD5-AS1 on LPS-induced apoptosis of vascular endothelial cells and expression of P21 and Cas?pase-3 proteins

2.6 過(guò)表達(dá)miR-133a-3p 能逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1 對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響 與LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC 組 相 比，LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p 組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6 的水平顯著升高（P<0.05），見(jiàn)表7。

表7 過(guò)表達(dá)miR-133a-3p能逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響（，n=9，pg/ml）Tab.7 Overexpression of miR-133a-3p reversed effect of FGD5-AS1 on expression of inflammatory cytokines in LPS-af?fected vascular endothelial cells（，n=9，pg/ml）

表7 過(guò)表達(dá)miR-133a-3p能逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1對(duì)LPS作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響（，n=9，pg/ml）Tab.7 Overexpression of miR-133a-3p reversed effect of FGD5-AS1 on expression of inflammatory cytokines in LPS-af?fected vascular endothelial cells（，n=9，pg/ml）

Note：Compared with LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC group，1）P<0.05.

IL-6 168.34±15.14 336.64±31.281）14.529<0.001 LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p t P 94.26±8.83 156.36±14.691）10.870<0.001 127.15±11.63 204.42±20.131）9.971<0.001 GroupsTNF-αIL-1

3 討論

膿毒癥發(fā)生時(shí)常伴隨多器官衰竭，并可加重炎癥反應(yīng)從而造成組織或器官損傷，研究表明Ln?cRNA 可通過(guò)靶向miRNA 參與多種炎癥反應(yīng)發(fā)生過(guò)程［9］。既往研究顯示LncRNA 異常表達(dá)可參與膿毒癥急性肺損傷發(fā)生過(guò)程［10］。因而探討與膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)分子機(jī)制有助于降低心臟、肺部等多器官障礙的發(fā)生率。

FGD5-AS1 在牙周炎、急性心肌梗死等疾病中呈低表達(dá)，并可能參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程［11-12］。但FGD5-AS1 在膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)尚未可知。本研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬膿毒癥引起的炎癥環(huán)境，結(jié)果顯示FGD5-AS1在LPS 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與上述研究報(bào)道結(jié)果相似。提示FGD5-AS1 表達(dá)量降低可能加重膿毒癥所致炎癥反應(yīng)。膿毒癥患者血清中炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6水平升高，降低炎癥因子水平可有效改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能［13］。本研究結(jié)果顯示LPS 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α、IL-1、IL-6水平升高，而FGD5-AS1過(guò)表達(dá)后細(xì)胞中TNF-α、IL-1、IL-6 水平明顯降低，提示FGD5-AS1 過(guò)表達(dá)可能通過(guò)降低炎癥反應(yīng)從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。細(xì)胞增殖與凋亡的失衡可促進(jìn)多種疾病發(fā)生及發(fā)展，研究表明P21可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，Caspase-3 作為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，其可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14-15］。本研究結(jié)果顯示LPS 處理后，血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率升高，P21、Cas?pase-3表達(dá)量升高，而FGD5-AS1過(guò)表達(dá)能夠明顯逆轉(zhuǎn)這一反應(yīng)，提示FGD5-AS1 過(guò)表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)P21、Caspase-3 表達(dá)從而抑制LPS 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

miR-133a-3p 在慢性阻塞性肺疾病中異常表達(dá)并可能參與疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程［16］。研究表明CX?CL12/CXCR4 通過(guò)激活miR-133a-3p 從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)［17］。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-133a-3p 的表達(dá)水平明顯升高，miR-133a-3p過(guò)表達(dá)聯(lián)合FGD5-AS1 過(guò)表達(dá)處理后，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率升高，P21、Caspase-3 表達(dá)量升高，TNF-α、IL-1、IL-6 水平明顯升高，說(shuō)明 miR-133a-3p過(guò)表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響。提示FGD5-AS1 過(guò)表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)miR-133a-3p 的表達(dá)從而抑制LPS 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖。

綜上所述，LPS 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中FGD5-AS1 表達(dá)降低，miR-133a-3p 表達(dá)增加，炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6 水平升高，凋亡率增加，存活率降低，而FGD5-AS1 過(guò)表達(dá)可靶向調(diào)控miR-133a-3p 的表達(dá)從而促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡，降低TNF-α、IL-1、IL-6 水平，為進(jìn)一步探討FGD5-AS1 調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，F(xiàn)GD5-AS1 可能為膿毒癥與并發(fā)癥潛在的治療靶點(diǎn)。本研究將進(jìn)一步探討FGD5-AS1 在膿毒癥或其他炎癥性疾病中的調(diào)控作用機(jī)制及其對(duì)其他信號(hào)通路的調(diào)控作用。