李夢(mèng)俊 張曉榮 王 婧 高艷萍 （山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，汾陽(yáng)032200）

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種在自然界中普遍存在的革蘭氏陰性微需氧細(xì)菌，在全世界50%以上人口的腸道內(nèi)定植，其感染胃竇上皮區(qū)并持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間［1］。有研究表明，Hp 已經(jīng)發(fā)展出復(fù)雜的形態(tài)特點(diǎn)來(lái)擴(kuò)大胃黏膜的炎癥程度，如螺旋形，鞭毛運(yùn)動(dòng)，趨化，和生產(chǎn)脲酶中和胃的酸性環(huán)境［2］。有來(lái)自細(xì)菌和宿主的多種因素參與了這些復(fù)雜的相互作用。另一方面，為了建立持久性感染，Hp通過(guò)模仿宿主抗原來(lái)逃避免疫系統(tǒng)，這種病原體有躲避免疫系統(tǒng)的能力，然后以宿主細(xì)胞的形式存在，從而導(dǎo)致免疫耐受［2-4］。此外，Hp 還具有多種基因，這些基因可能從寄主處獲取營(yíng)養(yǎng)以在寄主體內(nèi)存活更長(zhǎng)時(shí)間，Hp 的持續(xù)存在會(huì)引起慢性炎癥，并可能增加慢性疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，Hp的持續(xù)存在可能會(huì)造成骨骼肌衰減。

IL-1β 是區(qū)域性和全身性炎癥的主要刺激因子，是一種主要的促炎癥介質(zhì)，可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和具有血小板反應(yīng)蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶產(chǎn)生，可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨中膠原Ⅱ和蛋白多糖下調(diào)［5］。此外，IL-1β 刺激的骨骼肌細(xì)胞可激活環(huán)氧合酶-2（cy?clooxygenase-2，COX-2）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（in?ducible nitric oxide synthase，iNOS）表達(dá)，觸發(fā)前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和一氧化氮（nitric ox?ide，NO）釋放，引起慢性炎癥，誘發(fā)骨骼肌衰減［6］。

Hp感染率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，可引起全身性炎癥反應(yīng)，ZEMBRO?-?ACNYA 等［7］發(fā)現(xiàn)，肌肉減少癥（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“肌少癥”）者的血清炎癥因子水平升高，通過(guò)抑制炎癥患者肌肉質(zhì)量及力量均有明顯改善。2010 年老年肌少癥歐洲工作組（European Working Group on sarcopenia in older people，EWGSOP）［8］和 2011 年 國(guó) 際 肌 少 癥 會(huì) 議 工 作 組（International Sarcopenia Conference Working Group，ISCCWG）［9］進(jìn)一步將肌少癥定義為“一種廣泛的、漸進(jìn)性的骨骼肌量和肌力喪失，伴有身體活動(dòng)障礙、生活質(zhì)量降低等不良后果風(fēng)險(xiǎn)的綜合征”。有研究表明，在骨骼肌生成過(guò)程中，有3個(gè)起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子家族：配對(duì)盒蛋白（paired box，PAX）家族、同源異形框基因（sine oculis homeobox，SIX）家族和生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族，其中MRFs 在細(xì)胞成肌決定及終末分化階段起主要作用［10］。MRFs轉(zhuǎn)錄因子家族有4個(gè)成員：肌肉分化因子 1（myogenic differentiation 1，MYOD1）、生肌決定因子5（myogenesis determining factor 5，MYF5）、MYF6 和肌細(xì)胞生成素（myogenin，MYOG）。MYOD1是肌肉組織特異的轉(zhuǎn)錄因子，在肌細(xì)胞分化中起重要作用；MYOG 是成肌細(xì)胞終末分化階段的核心調(diào)控因子，作為分化調(diào)控因子參與成肌細(xì)胞的終末分化階段，當(dāng)MYOD1 或MYOG 表達(dá)下降時(shí)，肌細(xì)胞分化過(guò)程受阻，導(dǎo)致骨骼肌衰減，最終引起肌少癥［11］。因此，骨骼肌衰減的診斷成為防治肌少癥的突破點(diǎn)，以便實(shí)現(xiàn)肌少癥的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，提高老年人生存質(zhì)量，減少醫(yī)療資源的消耗，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與菌株 體重28～32 g 的雄性8 月齡C57BL/6 小鼠購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)室，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（晉）2015-0001。實(shí)驗(yàn)小鼠在25℃、相對(duì)濕度60%、通風(fēng)良好的環(huán)境下，每天給予充足的水分和食物飼養(yǎng)8個(gè)月。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 ELISA 試劑盒購(gòu)自上海西唐科技有限公司；pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 抗體購(gòu)自ABclonal 公司和博士德生物公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自博士德生物公司；BeyoRTTMⅡcDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒購(gòu)自天根生物公司；pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 引物購(gòu)自上海生工生物公司，引物序列分別為 pNF-κB（F：5'-CTGAAAAGCACCTGACAAAAGA-3'，R：5'-CTGTGTAGCCATCTGTTGAGTT-3'）、IL-1β（F：5'-TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG-3'，R：5'-AGGTCCACGGGAAAGA?CACAGG-3'）、MYOD1（F：5'-CGCCATCCGCTATATCGAGG-3'，R：5'-CTGTAGTCCATCATGCCGTCG-3'）、MYOG（F：5'-AGTGCCATCCAGTACATCGAG-3'，R：5'-AGGTTGTGGGCATCTGTAGG-3'）、β-actin（F：5'-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3'，R：5'-CAT?CACGATGCCAGTGGTA-3'）。

1.2 方法

1.2.1 物理方法測(cè)量小鼠的握力水平 簡(jiǎn)易握力計(jì)（100 N）一端固定，另一端系在小鼠尾巴根部，誘導(dǎo)小鼠四肢緊抓鐵網(wǎng)做攀爬動(dòng)作，同時(shí)記錄握力計(jì)變化，每只小鼠測(cè)量5次取平均值。

1.2.2 Hp復(fù)蘇及菌液制備 哥倫比亞固體培養(yǎng)基結(jié)合脫脂纖維羊血及混合抗生素制成血平板，細(xì)菌室溫融化后取50 μl 接種至制好的血平板，在37℃、5%O2、10%CO2、85%N2的環(huán)境下培養(yǎng)7～10 d，待細(xì)菌長(zhǎng)滿(mǎn)（無(wú)色透明，針尖樣細(xì)小或融合成片，表面光滑濕潤(rùn)）部分收集至1.5 ml EP 管，存于-80℃?zhèn)溆?；部分用無(wú)菌生理鹽水刮取制成新鮮Hp 懸液用于小鼠灌胃處理。

1.2.3 小鼠灌胃及處理 將24 只小鼠平均分為4 組：對(duì)照組（M）、低濃度組（L）、中濃度組（I）、高濃度組（H），6 只/組，對(duì)照組用生理鹽水處理，濃度組分別用低濃度0.3 ml、中濃度0.6 ml、高濃度0.9 ml Hp 懸液（菌液濃度調(diào)至1×109CFU/ml）處理。連續(xù)灌胃3 周，每周1 次，距最后1 次灌胃10 周后麻醉小鼠，取小鼠新鮮血液存于-80℃?zhèn)溆?，取胃組織、腓腸肌組織、比目魚(yú)肌組織部分存于-80℃?zhèn)溆?，部分?%多聚甲醛液中固定。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)IL-1β 根據(jù)雙抗體夾心法檢測(cè)小鼠血清中IL-1β 表達(dá)，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μl，將反應(yīng)板充分混勻后于37℃靜置40 min；洗滌液充分洗滌4～6次，晾干；每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μ（l空白除外），反應(yīng)板充分混勻后于37℃靜置20 min；洗板，同前；每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100 μl，反應(yīng)板于37℃靜置10 min；洗板，同前；每孔加入底物工作液100 μl，置于37℃避光反應(yīng)15 min；每孔加入100 μl終止液混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.5 HE 染色 石蠟切片于65℃烤箱烤片2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各20 min，乙醇梯度脫水，蒸餾水沖洗2 次；蘇木素染色1～2 min，1%鹽酸乙醇分化1 min，蒸餾水沖洗2 次，稀氨水藍(lán)化數(shù)秒；伊紅染色1～2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹(shù)膠封片。

1.2.6 免疫組化 石蠟切片于65℃烤箱烤片2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各20 min，乙醇梯度脫水，蒸餾水沖洗2次；滴加2%的H2O2，阻斷內(nèi)源性的H2O2酶，室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗3 次，再用PBS 緩沖液沖洗2次，甩去多余的液體；采用枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，濕盒中孵一抗，4℃ 過(guò)夜，PBS 緩沖液沖洗3 次，甩去多余的液體，接著孵二抗，37℃孵育30 min；DAB 顯色，蘇木素染色1～2 min，1%鹽酸乙醇分化1 min，自來(lái)水沖洗后返藍(lán)數(shù)秒，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹(shù)膠封片。

1.2.7 qPCR 檢測(cè) pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG的mRNA 表達(dá) 取30 mg 小鼠肌肉組織，加入1 ml Trizol 裂解液超聲破碎組織提取總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)總 RNA 濃度（ng/μl）。BeyoRTTMⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，42℃孵育60 min，80℃ 孵育 10 min。SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒配置PCR 反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性15 min，95℃ 變性10 s，60℃ 退火/延伸30 s，PCR反應(yīng)循環(huán)40次。

1.2.8 Western blot 檢測(cè) pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 蛋白質(zhì)表達(dá) 取30 mg 小鼠肌肉組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液超聲破碎組織提取總蛋白，BCA 試劑盒對(duì)蛋白定量，按照40 μg/孔的蛋白量進(jìn)行12%的SDS-PAGE，蛋白分離后轉(zhuǎn)至NC 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗4℃過(guò)夜，使用TBST 洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜，最后加入發(fā)光液于凝膠成像儀曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析。應(yīng)用GraphPad Prism8.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析及統(tǒng)計(jì)圖形制作。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的握力水平 與對(duì)照組相比，干預(yù)組小鼠的握力明顯下降，且隨著Hp 懸液濃度的增加，小鼠握力逐漸下降，呈負(fù)相關(guān)（P<0.05、P<0.01 或P<0.001，圖1）。

圖1 物理方法測(cè)量小鼠的握力水平Fig.1 Grip strength of mice was measured by physical method

2.2 ELISA檢測(cè)小鼠血清中IL-1β表達(dá)量 采用鼠源IL-1β ELISA 試劑盒以空白孔調(diào)零檢測(cè)其450 nm處的OD 值測(cè)量表達(dá)量，結(jié)果顯示IL-1β 在低濃度組（L）、中濃度組（I）、高濃度組（H）表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（M）（P<0.01或P<0.001），表明Hp干預(yù)小鼠一定時(shí)間后血清中的IL-1β明顯升高（圖2）。

圖2 ELISA檢測(cè)小鼠血清中IL-1β表達(dá)量Fig.2 Levels of serum IL-1β of mice was detected by ELISA

2.3 HE 染色觀(guān)察小鼠胃黏膜、小鼠腓腸肌組織、小鼠比目魚(yú)肌組織的炎癥浸潤(rùn)程度及小鼠骨骼肌變化情況 與對(duì)照組相比，隨著菌液濃度增加，小鼠胃黏膜組織炎癥浸潤(rùn)程度逐漸增加（圖3A）；小鼠腓腸肌組織炎癥浸潤(rùn)程度增加，高濃度組出現(xiàn)玻璃樣變性，肌肉組織有衰減的表現(xiàn)（圖3B）；小鼠比目魚(yú)肌組織炎癥浸潤(rùn)程度增加，肌肉組織有衰減表現(xiàn)（圖3C）。

圖3 各組小鼠HE染色結(jié)果（×200）Fig.3 Results of HE staining of mice in each group（×200）

2.4 免疫組化檢測(cè)骨骼肌組織中IL-1β、MYOG 的表達(dá) 與對(duì)照組相比，干預(yù)組（高濃度菌液組，因?yàn)楦邼舛染航M對(duì)小鼠骨骼肌組織的影響變化最明顯）IL-1β 在骨骼肌組織中的表達(dá)明顯增加，MYOG在骨骼肌組織中的表達(dá)明顯減少（P<0.001）；圖4A中深棕色信號(hào)分別代表IL-1β 和MYOG 的陽(yáng)性信號(hào)，淺棕色為背景顏色，圖 4B 為 IL-1β 和 MYOG 的陽(yáng)性信號(hào)百分比的統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖。

圖4 免疫組化檢測(cè)骨骼肌組織中IL-1β、MYOG表達(dá)（×200）Fig.4 Expressions of IL-1β and MYOG in skeletal mus?cle tissue detected by immunohistochemistry（×200）

2.5 qPCR 檢測(cè)小鼠肌肉組織中 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 的 mRNA 表達(dá) 與對(duì)照組相比，pNF-κB、IL-1β 表達(dá)量隨著菌液濃度的升高而增加，MYOD1、MYOG 表達(dá)量隨著菌液的濃度的升高而減少（P<0.01或P<0.001）。見(jiàn)圖5。

圖5 qPCR檢測(cè)小鼠肌肉組織中pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG的相對(duì)表達(dá)Fig.5 qPCR analysis of pNF-κB，IL-1β，MYOD1 and MYOG relative expressions in mice muscle tissue

2.6 Western blot 檢測(cè)小鼠肌肉組織中pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 的表達(dá) 如圖6 所示，與對(duì)照組相比，小鼠腓腸肌組織及比目魚(yú)肌組織中pNF-κB、IL-1β 蛋白的表達(dá)隨著菌液濃度的升高而增加，MYOD1、MYOG 表達(dá)量隨著菌液的濃度的升高而減少（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。

圖6 Western blot 檢測(cè)小鼠肌肉組織中 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG相對(duì)表達(dá)Fig.6 Western blot analysis of pNF-κB，IL-1β，MYOD1 and MYOG relative expression in mouse muscle tissue

3 討論

Hp是一種普遍存在的物種，在全世界50%以上人口的腸道內(nèi)定植［1］。在過(guò)去的20 年中，已經(jīng)建立了Hp 感染的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)研究疾病的發(fā)病機(jī)制，使用小鼠適應(yīng)的Hp 菌株（Sidney 菌株，SS1），LEE 等［12］建立了小鼠長(zhǎng)期高細(xì)菌定植模型。雖然Hp 被認(rèn)為是非侵入性的，但由于感染，會(huì)在胃黏膜中引起廣泛的炎癥反應(yīng)，這種反應(yīng)的特點(diǎn)是炎癥細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞的黏膜浸潤(rùn)，其主要由促炎性趨化因子如IL-1β 增強(qiáng)表達(dá)介導(dǎo)［13-15］。本研究結(jié)果證實(shí)，Hp 感染導(dǎo)致小鼠血清中的炎癥因子增加，尤其是IL-1β的表達(dá)量增加更明顯，同時(shí)還能激活NF-κB炎癥通路，經(jīng)過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，又會(huì)反過(guò)來(lái)增加IL-1β的表達(dá)。

骨骼肌的生成是一個(gè)非常復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。一些轉(zhuǎn)錄因子如PAX3、PAX7、SIX1、SIX4 等是決定成肌祖細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵上游調(diào)控因子，而成肌祖細(xì)胞的生肌決定及終末分化則由MRFs 調(diào)控［11］。在骨骼肌的生成過(guò)程中，有3 個(gè)起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子家族：PAX 家族、SIX 家族和MRFs家族。其中PAX家族蛋白和SIX家族蛋白在肌生成早、中期起主要作用，隨后表達(dá)量下降，MRFs 在細(xì)胞成肌決定及終末分化階段起主要作用［11］。在肌肉發(fā)育過(guò)程中，骨骼肌生成的決定階段和終末分化階段由MRFs轉(zhuǎn)錄因子嚴(yán)格調(diào)控。早在28年前就有研究表明MRFs 家族成員作為堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在非肌源性細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)可啟動(dòng)肌生成過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞向成熟轉(zhuǎn)化及細(xì)胞的分化［16］。MYOD1 和MYOG 是成肌細(xì)胞終末分化階段的核心調(diào)控因子，對(duì)于骨骼肌的生成具有雙重調(diào)控作用，一方面作為分化調(diào)控因子參與成肌細(xì)胞的終末分化階段，另一方面也作為生肌決定因子參與成肌細(xì)胞的生肌過(guò)程［11］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化、qPCR、Western blot 3種方法檢測(cè)了骨骼肌組織中肌肉分化相關(guān)蛋白MYOD1 和MYOG 的表達(dá)伴隨著炎癥浸潤(rùn)程度的增加而減少，從而抑制肌肉細(xì)胞的分化，引起骨骼肌衰減。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Hp 感染C57BL 小鼠可能通過(guò)介導(dǎo)IL-1β 導(dǎo)致骨骼肌衰減，其具體機(jī)制還需后期通過(guò)基因敲除和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)繼續(xù)驗(yàn)證。但這一發(fā)現(xiàn)可為骨骼肌衰減的治療及預(yù)防提供新的思路。