郭 強(qiáng) 陸紅玲 柯希賢 方世旭 徐 剛 （遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，遵義563000）

在中國，肺癌的發(fā)生率和死亡率在惡性腫瘤中排名第一［1］。眾所周知，肺腺癌是常見的肺癌類型之一，占肺癌發(fā)病率的40%，是導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)癌癥死亡的重要原因之一［2-4］。早期肺腺癌患者能夠通過手術(shù)治療獲得長期存活，而大多數(shù)中晚期患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，且對(duì)化學(xué)治療和放療效果反應(yīng)不佳，5年生存率不高于15%［5-6］。近年來，靶向治療使肺癌患者重燃起新的希望，但其預(yù)后仍不能令人滿意［7-8］。因此，需尋找新型生物標(biāo)志物以增加肺腺癌患者的早期診斷率，并通過標(biāo)志物識(shí)別預(yù)后不良的高?；颊撸\(yùn)用靶向治療以改善肺腺癌患者的預(yù)后。

SKA3 是紡錘體和動(dòng)粒相關(guān)復(fù)合物中的關(guān)鍵一員，位于復(fù)合體著絲點(diǎn)外層，在有絲分裂中發(fā)揮著重要作用［9-12］。研究發(fā)現(xiàn)，SKA3 在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高，升高SKA3 表達(dá)與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)。敲除SKA3 基因表達(dá)能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和遷移，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡，從而參與導(dǎo)致癌癥進(jìn)展［13］。此外，SKA3 表達(dá)升高與乳腺癌患者的總生存期（overall survival，OS）顯著相關(guān)，且下調(diào)SKA3 基因表達(dá)能遏制乳腺癌細(xì)胞增殖［14-15］。另外，SKA3 在腎細(xì)胞癌組織表達(dá)增高，敲低SKA3基因表達(dá)能遏制腎癌細(xì)胞生長和遷移［16］。SKA3 過表達(dá)能增加了宮頸癌細(xì)胞中p-Akt、cyclin E2、CDK2、cyclin D1、CDK4、E2F1 和 p-Rb 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移［12］。上調(diào)GNL3 和SKA3 基因表達(dá)也能使前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱，說明SKA3表達(dá)與前列腺癌進(jìn)展相關(guān)［17］。然而，SKA3 在肺腺癌中的表達(dá)、潛在預(yù)后價(jià)值和調(diào)控機(jī)制仍不為人知。因此，本研究是基于TCGA 數(shù)據(jù)庫中SKA3 mRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析SKA3 肺腺癌中的表達(dá)及其臨床價(jià)值。采用GSEA 分析SKA3 潛在調(diào)控的肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 患者樣本：取遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科進(jìn)行手術(shù)治療的16 例肺腺癌患者的癌組織及其配對(duì)非癌組織。本研究經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，16 例肺腺癌患者均簽署書面知情同意書，且術(shù)前未做其他特殊治療。RNA數(shù)據(jù)：TCGA 官網(wǎng)（https：//tcga-data. nci. nih. gov/tcga/）下載類型為HTSeq-FPKM 的肺腺癌SKA3 mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)和類型為BCR XML的肺腺癌患者的臨床資料。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理和分析 SKA3 mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)總樣本數(shù)量為594 例，其中正常肺組織樣本59 例，肺腺癌組織樣本535 例，一一配對(duì)肺腺癌患者57 例。對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)中的522 例肺腺癌患者的臨床病理特征和預(yù)后資料進(jìn)行篩選，剔除臨床病理特征參數(shù)不詳或不完整的病例信息及缺乏預(yù)后隨訪資料的病例后進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.2 GSEA 以SKA3 表達(dá)中位數(shù)值進(jìn)行分組后對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫基因集進(jìn)行GSEA。首先將TCGA數(shù)據(jù)庫中全部基因與SKA3 表達(dá)的相關(guān)性生成一個(gè)有序的基因列表，通過GSEA 分析SKA3高表達(dá)組與SKA3 低表達(dá)組對(duì)其他基因的影響。每次分析進(jìn)行1 000 次基因組排列［18］。通過P值和歸一化富集評(píng)分（NES）對(duì)每種表型富集的通路進(jìn)行分類。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析采用Perl語言和R 語言處理。Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)和邏輯回歸分析臨床病理學(xué)特征與SKA3 mRNA 表達(dá)之間的相關(guān)性，Cox回歸和Kaplan-Meier分析與肺腺癌預(yù)后相關(guān)臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性，TCGA 數(shù)據(jù)庫肺腺癌患者參數(shù)賦值見表1。NOMp<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GSEA 分析判斷顯著性富集的標(biāo)準(zhǔn)為NES>2，F(xiàn)DRp<0.01。

表1 肺腺癌患者臨床病理學(xué)特征賦值Tab.1 Clinicopathological characteristics of lung adeno?carcinoma patients

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織中SKA3 mRNA 表達(dá)升高 SKA3 mRNA 的表達(dá)在肺腺癌組織（2.523±2.221）中的表達(dá)比非癌組織（0.247±0.150）高（圖1A）。進(jìn)一步對(duì)TCGA 肺腺癌患者進(jìn)行配對(duì)分析發(fā)現(xiàn)SKA3 mRNA表達(dá)在肺腺癌組織（2.417±1.838）中的表達(dá)比配對(duì)非癌組織（0.241±0.150）高（圖1B），初步說明在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中SKA3的表達(dá)被激活。

圖1 SKA3高表達(dá)于肺腺癌組織Fig.1 High expression of SKA3 in lung adenocarcinoma tissues

2.2 SKA3 高表達(dá)與臨床病理學(xué)特征相關(guān) 研究發(fā)現(xiàn)SKA3 表達(dá)水平與肺腺癌患者的年齡、性別、臨床分期、T 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.01）。單因素分析發(fā)現(xiàn)，SKA3 表達(dá)水平與肺腺癌患者的臨床病理學(xué)特征相關(guān)（表2）。SKA3 表達(dá)與肺腺癌患者的性別（OR=1.75，女性 vs 男性），臨床分期（OR=2.34，Ⅰvs Ⅲ）、T分期（OR=0.66，T1vs T2）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（OR=1.55，N0vs N1和OR=2.14，N0vs N2）顯著相關(guān)（P<0.05）。以上結(jié)果提示SKA3 高表達(dá)的肺腺癌患者比SKA3 低表達(dá)的肺腺癌患者更容易進(jìn)展到晚期，預(yù)后更差。

表2 SKA3高表達(dá)與肺腺癌臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of SKA3 overexpression with clinicopathological features of lung adenocarcinoma

2.3 SKA3 與肺腺癌患者預(yù)后的相關(guān) Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)SKA3 的肺腺癌患者比低表達(dá)SKA3 的患者預(yù)后更糟糕（P=0.003，圖2F）。單因素分析顯示，SKA3 高表達(dá)、臨床分期、T 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與肺腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)（P<0.05，表3）。多因素分析顯示，SKA3 表達(dá)水平和臨床分期是肺腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05，表3）。

表3 肺腺癌患者預(yù)后的臨床病理學(xué)特征分析Tab.3 Clinicopathological features of prognosis in pa?tients with lung adenocarcinoma

圖2 SKA3 表達(dá)水平與肺腺癌患者的臨床病理學(xué)特征及總生存期相關(guān)Fig.2 SKA3 expression level correlated with clinicopatho?logical characteristics and overall survival of lung adenocarcinoma patients

2.4 GSEA GSEA 分析提示SKA3 高表達(dá)組中與多條信號(hào)通路具有明顯富集關(guān)系。以GSEA NES>2和NOMp<0.01 為篩選條件出18 條相關(guān)信號(hào)通路（表4）。發(fā)現(xiàn)SKA3 高表達(dá)組中顯著富集到細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制和p53 信號(hào)通路等相關(guān)的基因集（P<0.01，圖3）。預(yù)示著SKA3 可能通過細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和p53信號(hào)通路參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。

圖3 SKA3高表型中富集的相關(guān)信號(hào)通路Fig. 3 Enrichment of related signaling pathways in a high SKA3 phenotype

表4 SKA3高表達(dá)組中GSEA NES>2，F(xiàn)DRp<0.01相關(guān)的信號(hào)通路Tab.4 Signaling pathways associated with enrichment score>2 and FDRp<0.01 in SKA3 high expression group

2.5 驗(yàn)證SKA3 mRNA 在肺腺癌中的表達(dá)情況通過qRT-PCR 檢測(cè)16 例肺腺癌患者組織和非癌組織中SKA3 mRNA 表達(dá)水平，并分析其表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性（表5）。發(fā)現(xiàn)SKA3 mRNA 在肺腺癌患者癌組織中的表達(dá)增高（P<0.05）然而，SKA3 mRNA 表達(dá)水平與肺腺癌患者年齡、性別、臨床分期、腫瘤大小等不具有相關(guān)性。

表5 SKA3表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Tab.5 Relationship between SKA3 expression level and clinicopathological parameters in patients with lung adenocarcinoma

3 討論

SKA3 參與有絲分裂過程，且與細(xì)胞增殖與凋亡密切相關(guān)［12］。研究表明，SKA3 表達(dá)水平與結(jié)直腸癌、乳腺癌和前列腺癌等腫瘤預(yù)后有關(guān)［12-17］。然而，SKA3 與肺腺癌之間的關(guān)系未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫中的肺腺癌RNA 數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可視化處理，且發(fā)現(xiàn)SKA3 在肺腺癌組織中出現(xiàn)高表達(dá)的征象。此外，在16例臨床肺腺癌組織樣本中也發(fā)現(xiàn)了SKA3 mRNA 表達(dá)水平升高。單因素分析說明，SKA3 高表達(dá)的肺腺癌分期較晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目更多和預(yù)后更差有關(guān)。SKA3 高表達(dá)、臨床分期、T 分期和N 分期均可能是影響肺腺癌患者的預(yù)后。多因素分析發(fā)現(xiàn)SKA3 高表達(dá)和臨床分期是肺腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。GSEA 發(fā)現(xiàn)SKA3高表達(dá)組與細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制和p53 信號(hào)通路顯著富集，提示SKA3 高表達(dá)可能通過調(diào)控細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制和p53 信號(hào)通路使肺腺癌進(jìn)展，導(dǎo)致肺腺癌患者預(yù)后不良。

生理狀態(tài)下，細(xì)胞周期能維持著自身穩(wěn)定，防止細(xì)胞過度生長和增殖，失去細(xì)胞周期的調(diào)控則導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［19-21］。p53信號(hào)通路是細(xì)胞周期調(diào)控中的一條重要的通路，該通路異常常導(dǎo)致多種細(xì)胞周期因子表達(dá)異常，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖和腫瘤細(xì)胞耐藥。如環(huán)指蛋白Znf179 可通過p53/p27/p21 信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)膠質(zhì)瘤（glioma，GBM）細(xì)胞向高級(jí)分化轉(zhuǎn)變，并遏制 GBM 發(fā)生發(fā)展［22］。TP53 介導(dǎo)的糖酵解和凋亡誘導(dǎo)因子（TIGAR）能調(diào)控p53 表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞G1 期阻滯。TIGAR 調(diào)控抑制細(xì)胞周期蛋白因子 CDK-2、CDK-4、CDK-6、Cyclin D、Cyclin E 的合成，使RB 蛋白去磷酸化增強(qiáng)，從而遏制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變（G1-S 期）［23］。p53 失活激活了 Raf/Mek/Erk 級(jí)聯(lián)信號(hào)通路以提高腫瘤細(xì)胞增殖能力［24］。有絲分裂到DNA 復(fù)制過程是細(xì)胞周期中的重要步驟。致使DNA復(fù)制異常與人類多種疾病相關(guān)。如MicroRNA-26a/b 能通過靶向CDC6遏制肺癌細(xì)胞DNA復(fù)制，調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移［25］。SKA3 能磷酸化 CDK1 和結(jié)合Ndc80C，促使SKA 復(fù)合體參與有絲分裂過程，調(diào)控細(xì)胞生長［12］。本研究通過 GSEA 發(fā)現(xiàn) SKA3 高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變、DNA復(fù)制和p53信號(hào)通路，這與文獻(xiàn)報(bào)道的腫瘤相關(guān)調(diào)控機(jī)制相符合。因此，推測(cè)細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制和p53 信號(hào)通路也可能是肺腺癌發(fā)生發(fā)展中重要調(diào)控通路。

本研究使用的TCGA 數(shù)據(jù)庫樣本量大，臨床資料完整，可信度高。不足之處在于TCGA 數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)是SKA3 mRNA 水平，雖在16 例肺腺癌樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，但無法完全代表SKA3 蛋白水平，且未在蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證。本研究對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)分析和GSEA 預(yù)測(cè)的通路為進(jìn)一步深入研究SKA3 在肺腺癌中的作用提供了線索和依據(jù)。