何謙益 石曉娟 連晶瑤 劉莎莎 張 毅

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心，鄭州450052）

卒中是繼心臟病和癌癥之后的第三大疾病死亡原因，并且具有最高的致殘率，約有80%的卒中患者遺留有終身殘疾［1-2］。在世界范圍內(nèi)，卒中造成了患者死亡率及傷殘調(diào)整壽命年仍居高不下［3］。因此，找到有效治療卒中的新方法刻不容緩。卒中可以分為缺血性和出血性兩種，其中85%為缺血性的，又稱之為腦梗死。目前，腦梗死的概念已經(jīng)由單純的血管疾病擴(kuò)展到了由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、血管細(xì)胞以及基質(zhì)成分、免疫細(xì)胞等多種成分之間相互作用的復(fù)雜疾病。其中免疫系統(tǒng)引起的繼發(fā)性神經(jīng)炎癥既可以加劇缺血性神經(jīng)損傷，導(dǎo)致大量神經(jīng)元死亡，也可以發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的積極作用，近年來逐漸成為腦梗死研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［4］。

調(diào)節(jié)性 B 細(xì)胞（regulatory B cells，Breg）是維持免疫耐受的免疫抑制性細(xì)胞，Breg 細(xì)胞可以通過分泌 IL-10、IL-35 和 TGF-β 來抑制包括 T 細(xì)胞在內(nèi)的促進(jìn)炎癥性細(xì)胞的擴(kuò)增進(jìn)而抑制免疫反應(yīng)［5］。既往研究表明，Breg 在缺血性卒中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭心馨l(fā)揮強(qiáng)大的免疫抑制功能并且有潛在的神經(jīng)保護(hù)功能［6］。即使在腦梗死發(fā)生 24 h 后給予 Breg 細(xì)胞，也能大大降低實(shí)驗(yàn)小鼠的腦梗死體積，其治療時(shí)間窗遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了目前腦梗死治療領(lǐng)域最有效的組織型纖溶酶原激活劑［7］。但是目前仍缺乏Breg細(xì)胞在急性腦梗死患者中的相關(guān)研究。本研究旨在檢測(cè)急性腦梗死患者外周血中Breg 細(xì)胞的表達(dá)，并且分析Breg 與患者預(yù)后的關(guān)系，為后續(xù)Breg 的臨床轉(zhuǎn)化研究提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 資料 納入2018年10月至2019年10月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的癥狀發(fā)作7 d 內(nèi)的首發(fā)腦梗死患者128 例（急性腦梗死組）以及同時(shí)期性別、年齡相匹配的體檢者100例（健康對(duì)照組）。所有納入研究的對(duì)象均自愿參加本研究并簽署了知情同意書。所有腦梗死患者均符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且均經(jīng)過核磁共振檢查確認(rèn)。納入的腦梗死患者排除標(biāo)準(zhǔn)為：①患有感染、自身免疫性疾病、癌癥或其他可能影響免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的疾??；②近期應(yīng)用過類固醇、免疫抑制劑等影響外周血中免疫細(xì)胞水平的藥物；③妊娠或合并其他重要臟器功能不全者。兩組納入對(duì)象一般臨床資料的比較：除急性腦梗死組高血壓患病率高于健康對(duì)照組（P=0.009）之外，其余在性別、年齡、吸煙比例、糖尿病患病率、血清三酰甘油和膽固醇水平等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 急性腦梗死患者與健康對(duì)照的一般情況Tab. 1 Clinical characteristics of acute ischemic stroke patients and healthy controls

1.2 方法

1.2.1 臨床參數(shù)的采集以及患者疾病嚴(yán)重程度評(píng)價(jià) 對(duì)納入對(duì)象的臨床資料如性別、年齡、糖尿病病史、高血壓病史、房顫病史、吸煙史、冠心病病史、飲酒史等進(jìn)行了采集。并在納入對(duì)象入院當(dāng)天或第二天采集清晨空腹靜脈血，按我院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）水平。用酶聯(lián)免疫吸附法（R&D Systems Inc，Minneapolis，MN）檢測(cè) IL-10、TGF-β 與IL-35 的含量。對(duì)所有急性腦梗死患者進(jìn)行了為期90 d 的隨訪。隨訪結(jié)束時(shí)進(jìn)行modified Rankin Scale（mRS）評(píng)分，mRS 評(píng)分 0～2 分為預(yù)后好，3～5分為預(yù)后差。

1.2.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血中總B 細(xì)胞與Breg 細(xì)胞 取每位納入對(duì)象空腹清晨靜脈血5 ml用肝素鈉抗凝后采用梯度-密度離心法分離外周單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。向分離出來的PBMC 中加入an?ti-CD19、anti-CD24 及 anti-CD38 抗體，所有抗體均購自Biolegend公司?？贵w加入后4℃避光孵育30 min，再用 PBS 清洗細(xì)胞并用 300 μl 的 FACS Buffer 將細(xì)胞重懸，流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）檢測(cè)總B 細(xì)胞（CD19+）與Breg細(xì)胞（CD19+CD24highCD38high）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析或者χ2檢驗(yàn)比較兩組納入對(duì)象的一般臨床資料。用t檢驗(yàn)分析兩組納入對(duì)象 Breg、總 B 細(xì)胞、IL-10、TGF-β 及 IL-35 水平的差異。多因素分析采用Logistic回歸分析法，受試者工作特征（ROC）曲線用于確定總Breg、IL-10、TGF-β以及IL-35 水平，預(yù)測(cè)急性腦梗死患者較好預(yù)后的截?cái)帱c(diǎn)水平。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組納入對(duì)象PBMC 中Breg 細(xì)胞 與健康對(duì)照組相比，急性腦梗死患者外周血中B 細(xì)胞的比例有所上升（22.05%±3.21% vs 18.21%±2.89%，P<0.001），但是 Breg 細(xì)胞比例顯著上升（7.56%±1.12%vs 1.48%±0.54%，P<0.001），詳見表2。

表2 急性腦梗死患者與健康對(duì)照外周血中的Breg比較Tab.2 Breg in PBMC of patients with acute ischemic stroke and healthy controls

2.2 兩組納入對(duì)象血清中 IL-10、TGF-β 與 IL-35 水平 與健康對(duì)照組相比，急性腦梗死組患者血清中的IL-10、TGF-β 與IL-35水平顯著上升（表3）。但是Breg 細(xì)胞的表達(dá)水平僅與血清IL-10 的含量呈正相關(guān)（圖1）。

圖1 Breg比例與TGF-β、IL-10以及IL-35水平的相關(guān)性Fig.1 Correlation between Breg percentage and TGF-β，IL-10 as well as IL-35 levels

表3 急性腦梗死患者與健康對(duì)照血清中IL-10、TGF-β 與IL-35比較Tab.3 Serum IL-10，TGF-β and IL-35 level in acute isch?emic stroke and healthy controls

2.3 急性腦梗死預(yù)后影響因素的Logistic分析 以Breg比例、血清IL-10、TGF-β、IL-35水平，年齡、性別（女=0，男=1），吸煙史（無=0，有=1），高血壓病史（無=0，有=1），糖尿病病史（無=0，有=1）等為自變量，以是否為急性腦梗死較好預(yù)后為因變量，進(jìn)行Logistic回歸（表4）。結(jié)果顯示僅Breg 比例是預(yù)后的獨(dú)立影響因素（OR：3.382，95%CI：1.978～5.782）。

表4 急性腦梗死預(yù)后影響因素的Logistics分析Tab.4 Logistics analysis of factors affecting prognosis of acute ischemic stroke

2.4 Breg 比例，血清 IL-10、TGF-β 和 IL-35 水平對(duì)急性腦梗較好預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 Breg 比例預(yù)測(cè)急性腦梗較好預(yù)后的曲線下面積為0.818（0.735～0.900），當(dāng)總 Breg 比 例為 7.95% 時(shí) ，特 異度 為83.3%，敏感度為74.0%（圖2、表5）。而血清IL-10、TGF-β和IL-35水平不能較好地預(yù)測(cè)患者預(yù)后。

圖2 Breg、TGF-β、IL-10和IL-35預(yù)測(cè)腦梗死的ROC曲線Fig.2 ROC analysis for Breg，TGF-β，IL-10 and IL-35 levels in acute ischemic stroke

表5 Breg、TGF-β、IL-10及IL-35對(duì)急性腦梗死的預(yù)測(cè)價(jià)值Tab.5 Predictive value of Breg，TGF-β，IL-10 and IL-35 in acute ischemic stroke

3 討論

腦梗死發(fā)生24 h 后，由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫就開始激活［8］。一般認(rèn)為，B 淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原分子的抗體，在腦梗死發(fā)病后通過體液免疫進(jìn)一步加重神經(jīng)元的損傷，甚至可以導(dǎo)致卒中后癡呆［9］。但是，在腦梗急性期B 細(xì)胞表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，B 細(xì)胞缺乏會(huì)導(dǎo)致小鼠梗死面積增加，死亡率增加，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的卒中后炎癥反應(yīng)以及更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺失［7］。并且在急性卒中患者中，外周B 細(xì)胞數(shù)量的減少預(yù)示著較差的預(yù)后［10］。B 細(xì)胞的這種神經(jīng)保護(hù)功能主要與 Breg 這一 B 細(xì)胞亞型有關(guān)［7，11-12］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Breg 可以通過分泌IL-10、IL-35 和TGF-β在多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎、重癥肌無力等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起重要的免疫抑制作用［13-14］。而在腦梗死動(dòng)物模型中，Breg主要通過分泌IL-10來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［6］。Breg 過繼輸入腦梗死小鼠后，通過減少浸潤(rùn)至缺血腦組織中的激活T細(xì)胞與單核細(xì)胞數(shù)量，減少缺血腦組織周圍炎癥因子如TNF-a 和IL-17的含量；增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的數(shù)量；以及減輕腦梗死后脾臟萎縮，增加脾臟中免疫細(xì)胞數(shù)量等多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［6］。

既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比野生小鼠，免疫缺陷小鼠腦梗死面積更大，神經(jīng)功能受損更嚴(yán)重，過繼Breg 之后免疫缺陷小鼠的腦梗死面積減少并且神經(jīng)功能有所好轉(zhuǎn)，但是過繼回輸?shù)腂reg 只存在于小鼠外周血中，提示主要由外周Breg 發(fā)揮腦梗后神經(jīng)保護(hù)作用［7］，所以本試驗(yàn)旨在分析急性腦梗死患者外周血Breg 的比例及其臨床意義。發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死患者的外周血中，B 細(xì)胞的比例輕度升高，而Breg的比例顯著升高。推測(cè)B細(xì)胞比例輕度升高的原因是腦梗死發(fā)生后B細(xì)胞較晚進(jìn)入腦梗死灶發(fā)揮特異性免疫功能［4］，而進(jìn)入腦梗死灶的免疫細(xì)胞會(huì)因?yàn)檫^度激活而導(dǎo)致凋亡，因此相比較其他免疫細(xì)胞，B 細(xì)胞的凋亡比例低故而整體比例上調(diào)。既往研究表明，炎癥因子如 IL-1β、IL-6、IL-21 等可以促進(jìn)Breg 的分化［5］，而這些炎癥因子不僅在腦梗死灶并且在外周血中也顯著增加［15］，故而Breg 不僅凋亡比例低，增殖分化程度也增加，所以其比例顯著上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，雖然急性腦梗死患者血清IL-10、TGF-β 和 IL-35 水平較健康對(duì)照均上升，但是Breg 水平只與血清IL-10 水平呈正相關(guān)，提示Breg可能主要通過分泌IL-10 發(fā)揮作用。為了說明Breg比例與腦梗患者較好預(yù)后之間的關(guān)系，進(jìn)行Logistic回歸，結(jié)果表明Breg 細(xì)胞比例每增加1%，患者獲得較好預(yù)后的概率增加 2.5 倍（OR：3.508；95%CI：2.071～5.943），說明Breg 細(xì)胞比例越高，患者的預(yù)后越好。上述結(jié)果與既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

除了Breg，其他類型的免疫細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）、調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞都可以減輕腦梗死后炎癥反應(yīng)［13］。在這些細(xì)胞中，研究最為深入的是Treg 細(xì)胞。腦梗死發(fā)生后Treg 細(xì)胞可以通過分泌TFG-β 和IL-10；表達(dá)跨膜抑制分子 CTLA-4、CD39；消耗促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的IL-2；分泌細(xì)胞溶解分子如顆粒酶和穿孔素等途徑發(fā)揮強(qiáng)大的免疫抑制功能［16］。與 Treg 細(xì)胞相比，Breg 有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：①目前關(guān)于Treg 在腦梗死中的作用尚無定論，有些研究提示Treg 對(duì)腦梗死起保護(hù)作用，而有些研究卻得出相反的結(jié)論［16］。SEIFERT 等［6］發(fā)現(xiàn)，Treg 細(xì)胞在減小MCAO 后梗死體積方面并沒有顯著作用。相反，Breg 細(xì)胞亞群可能在減少梗死體積以及神經(jīng)炎癥方面發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。②Breg 也可以通過增加Treg的數(shù)量來發(fā)揮免疫抑制作用。③Treg細(xì)胞可以通過LFA-1/ICAM-1 途徑增強(qiáng)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與血小板之間的相互作用，導(dǎo)致體內(nèi)微血管血栓形成，而Treg 介導(dǎo)的微血管血栓形成與腦梗后期退行性改變相關(guān)［17］。而目前的研究尚未發(fā)現(xiàn)Breg 有促進(jìn)微血管血栓形成的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死患者外周血中Breg 細(xì)胞的比例明顯較正?；颊咴龈撸一颊哐逯蠦reg分泌的細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β和IL-35也增高。并且Breg 的增高與患者的較好預(yù)后呈正相關(guān)。Breg有望成為治療急性腦梗死的新手段。