武 靜， 王 慧， 楊 毅， 李堯鋒， 王俊霞， 楊莎莎

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院五官科，貴州 貴陽 550002)

腸易激綜合征(irriTab.bowel syndrome，IBS)是以反復(fù)腹痛為主要發(fā)病特征的功能性胃腸道疾病[1]。以往學(xué)者對IBS內(nèi)臟痛的研究多集中在神經(jīng)元[2]，而忽視了在神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用的小膠質(zhì)細(xì)胞。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大建中湯可以降低內(nèi)臟高敏感，從而減輕腹痛[3-4]。本次實驗通過觀察大鼠脊髓腰骶段BDNF蛋白，及ox42和P2X4受體表達(dá)情況，進(jìn)而揭示大建中湯治療IBS內(nèi)臟痛的神經(jīng)調(diào)劑機制，為IBS內(nèi)臟痛的藥物治療提供新的作用靶點和治療方向。

1 材料

1.1 藥物 大建中湯中的蜀椒、干姜、人參由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)汪毅教授鑒定為正品。按《金匱要略》原方，蜀椒二兩(6 g)、干姜四兩(12 g)、人參二兩(6 g)，配伍后制成1.5 g/mL質(zhì)量濃度的水浸液；匹維溴銨片(美國Mylan Laboratories SAS公司，批號H20160396，規(guī)格50 mg/片)；佐劑液態(tài)鋁(美國Pierce公司，批號QD218415A)；卵清白蛋白(OVA，美國Sigma公司，批號052K1275)。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，雌鼠12只，雄性6只，體質(zhì)量150～170 g，由達(dá)碩生物科技有限公司提供，實驗動物使用許可證號SYXK(川)2013-24。自由飲食1周后，為使雌鼠有效懷孕，分別將2只雌鼠和1只雄鼠放在一籠，雌鼠懷孕后再分開喂養(yǎng)。待乳鼠出生后，選擇體質(zhì)量為(6.42±0.57)g的48只雄性未斷乳乳鼠作為實驗對象。

1.3 試劑 注射用戊巴比妥鈉(美國SCRC公司，批號WS20060401，規(guī)格0.5 g)；ox42(英國Abcam公司)，二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司，PV-6001、PV-6002)，DAB顯色劑(北京博奧森有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0009)；預(yù)染蛋白Marker(美國Thermofisher公司，批號26617)；底物化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國Affinity公司，批號KF001)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Hybond公司)；聚丙烯酰胺電泳(PAGE)凝膠快速制備試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司，批號PG112)；大鼠P2X4、BDNF多克隆抗體和生物素化山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)(H+L)[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，批號ab59246、ab5079]；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，批號GXP199629)。無水乙醇(江蘇海興化工有限公司，批號GB678-90)，PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ZLI-9062)；蒸餾水自制。

1.4 儀器 電熱蒸餾水器(武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司，型號HS.Z68.5)；垂直電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號JY-JX5L)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司，型號DYCZ-25E)；石蠟切片機(德國萊卡公司，型號RM2135)；恒溫水浴鍋(上海勝衛(wèi)電子科技有限公司，型號J-HH-4A)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司，型號80i)；圖片成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，型號MIAS2000)。

2 方法

2.1 分組與給藥 將48只雄性未斷乳乳鼠喂養(yǎng)第2天隨機分為6組，每組8只，分別為正常對照組、模型組、匹維溴銨組(陽性對照，根據(jù)文獻(xiàn)[5]方法設(shè)置劑量為0.045 g/kg)和大建中湯高、中、低劑量組(10.8、5.4、2.7 g/kg，分別根據(jù)人每千克體質(zhì)量臨床用量的14、7、3.5倍劑量)。造模成功后第2天，各組大鼠均按0.1 mL/10 g灌胃給藥相應(yīng)藥物(溶劑均為純凈水)，正常對照組和模型組大鼠灌胃等量純凈水，每天1次，連續(xù)14 d。

2.2 模型制備 除正常組母子同籠正常飲食外，其余各組根據(jù)文獻(xiàn)[6]改良制備IBS內(nèi)臟痛大鼠模型。從出生第2天起母嬰分離3 h/d(8:00～11:00)，期間不予哺乳；第8～21天增加0.5%乙酸直腸內(nèi)刺激，每天1次，每隔2 d增加0.1 mL，直至0.5 mL為止，正常組等量生理鹽水灌腸。至第22天起，正常飼養(yǎng)至第41天；第42、46天腹腔注射30 mg/mL OVA 1 mL，正常組注射等量PBS；第47～57天正常喂養(yǎng)，至此完成造模；第58天通過腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reaction，AWR)評價腸道敏感度，以模型組AWR評分高于正常組(P<0.05)為造模成功。

2.3 腹壁撤退反射(AWR)檢測 檢測時分別給予各組大鼠80、60、40、20 mmHg壓力，評價結(jié)腸擴張導(dǎo)致的大鼠反應(yīng)情況。1次擴張時間為20 s，重復(fù)6次，每次間隔4 min，取6次平均值。給予刺激時評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]，即0分，大鼠情緒穩(wěn)定；1分，偶有扭動頭部；2分，腹背部肌肉輕微收縮；3分，腹背肌肉收縮的基礎(chǔ)上出現(xiàn)腹部抬離地面；4分，腹部高離地面致使腹部呈弓狀。

2.4 取材 AWR檢測完成后采用腹腔注射戊巴比妥鈉(0.4%，10 mL/kg)麻醉各組大鼠，迅速切開腹腔，暴露脊髓段取腰骶段(L6～S2)，置于4%甲醛溶液中4 ℃固定12 h。

2.5 免疫組化染色檢測ox42表達(dá) 脊髓組織的石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后用3%雙氧水孵育10 min，PBS沖洗2 min×3次。滴加一抗兔抗鼠多克隆抗體ox42(1∶200)37 ℃孵育2 h，PBS沖洗2 min×3次。滴加二抗山羊抗兔IgG抗體-HR多聚體PV-6001和山羊抗小鼠IgG抗體-HR多聚體PV-6002，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗2 min×3次。DAB顯色,蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水、透明、封片，各組取10張切片，應(yīng)用軟件采集分析圖像。每張切片隨機選取5個400倍視野，觀察陽性細(xì)胞數(shù)。

2.6 Western blot檢測P2X4、BDNF蛋白表達(dá) 將脊髓腰骶段剪成碎片裂解勻漿，離心(4 ℃、12 000 r/min，10 min)后提取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白經(jīng)變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜加入適量封閉液，放入相應(yīng)的一抗溶液，37 ℃恒溫水浴搖床上封閉2 h，搖床上洗膜3次，將洗好的PVDF膜放于配制好的二抗溶液，搖床上孵育2 h再洗膜；采用ECL顯色，并根據(jù)不同顯影光強度調(diào)整曝光條件用圖片分析軟件進(jìn)行掃描分析，以目的蛋白與β-actin密度比值作為待測目的蛋白相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況 正常組大鼠進(jìn)食正常，毛發(fā)光澤，行動靈活；造模大鼠毛發(fā)失去光澤，行動遲緩，喜好扎堆，收腹、舔舐腹部等現(xiàn)象；灌服大建中湯和匹維溴銨后，大鼠進(jìn)食和毛發(fā)恢復(fù)正常，舔舐腹部現(xiàn)象消失。

3.2 大建中湯對IBS內(nèi)臟痛大鼠模型腹痛的影響 與正常組比較，模型組AWR評分在60、40、20 mmHg壓力下增加，腸道痛覺上升(P<0.05，P<0.01)，證明成功造模；與模型組比較，AWR評分在40、20 mmHg壓力下，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組減少(P<0.05，P<0.01)，降低模型大鼠腸道痛覺；與匹維溴銨組比較，在40 mmHg壓力下的AWR評分，大建中湯高劑量組治療效果要優(yōu)于匹維溴銨組(P<0.05)。見表1。

表1 大建中湯對各組大鼠AWR評分的影響(分，

3.3 大建中湯對IBS內(nèi)臟痛模型大鼠脊髓腰骶段ox42陽性表達(dá)的影響 ox42陽性出現(xiàn)棕黃色顆粒，主要定位在細(xì)胞胞質(zhì)中，少量定位在細(xì)胞核中。與正常組比較，模型組ox42個數(shù)增加(P<0.01)；與模型組比較，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組ox42個數(shù)降低(P<0.01)，大建中湯低劑量組ox42個數(shù)降低(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 大建中湯對各組大鼠ox42陽性表達(dá)的影響

圖1 大建中湯對各組大鼠ox42陽性表達(dá)的影響(IHC，×400)Fig.1 Effects of Dajianzhong Decoction on positive expression of ox42 in rats of various groups (IHC，×400)

3.4 大建中湯對IBS內(nèi)臟痛模型大鼠脊髓腰骶段P2X4、BDNF的影響 與正常組比較，模型組P2X4、BDNF蛋白水平增加(P<0.01)；與模型組比較，匹維溴銨組，大建中湯高、中劑量組P2X4、BDNF蛋白水平降低(P<0.01)，大建中湯低劑量組P2X4、BDNF蛋白水平降低(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 大建中湯對IBS內(nèi)臟痛模型大鼠P2X4、BDNF蛋白的影響

注：A為正常組，B為模型組，C為大建中湯低劑量組，D為大建中湯中劑量組，E為大建中湯高劑量組，F(xiàn)為匹維溴銨組。圖2 大建中湯對IBS內(nèi)臟痛模型大鼠P2X4、BDNF蛋白的影響Fig.2 Effects of Dajianzhong Decoction on P2X4 and BDNF proteins in IBS rat models with visceral pain

4 討論

隨著人們對IBS內(nèi)臟痛的認(rèn)識逐漸加深，有學(xué)者提出了神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)失調(diào)機制[8]，但因發(fā)病機制仍未明確，臨床尚未有特效藥。中醫(yī)學(xué)將IBS歸納為“腹痛”“泄瀉”等范疇，雖病位在腸，但其本在脾，故證候類型多歸納為脾虛證或脾陽虛證[9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病位在脾胃，病因有氣滯、感寒、血凝、蟲積等，病機為脾胃虛寒，運化乏力，氣血不足“不榮則痛”及氣機阻滯，氣血經(jīng)脈運行不暢“不通則痛”?！督鹭乙浴酚涊d的大建中湯是治療腹痛的經(jīng)典方劑，針對腹痛病位在脾胃，脾胃虛寒之證。臨床研究也表明大建中湯能夠治療多種急慢性內(nèi)臟痛，療效確切[10]。

因IBS病因復(fù)雜，所以本實驗通過母嬰分離方法造成新生期大鼠早期負(fù)性生活事件導(dǎo)致其成年后內(nèi)臟痛覺敏化；采用乙酸刺激損傷結(jié)直腸黏膜造成大鼠內(nèi)臟高敏感性；再利用卵清白蛋白腹腔注射方式使其侵入損傷的腸道致敏等，建立更符合IBS實際情況的綜合性動物模型。本實驗結(jié)果表明，造模大鼠出現(xiàn)行動遲緩、收腹、舔舐腹部、肛周污濁等IBS內(nèi)臟痛癥狀。同時，IBS模型大鼠內(nèi)臟敏感性增加(P<0.05,P<0.01)，符合IBS臨床特點。因而本實驗?zāi)Ｐ途哂休^理想的臨床實用意義。

AWR評分是IBS內(nèi)臟痛的主要檢測手段。本次研究結(jié)果表明，IBS內(nèi)臟痛大鼠AWR評分在3個擴張壓力均有升高，表明模型大鼠腸道在長期的傷害性刺激下形成IBS慢性內(nèi)臟痛，由于中樞以及外周的雙重疼痛敏化，大鼠痛閾降低，痛行為表現(xiàn)明顯。與模型組比較，經(jīng)大建中湯治療后，大鼠AWR評分在3個擴張壓力下均降低，趨于正常。表明大建中湯能夠使IBS內(nèi)臟痛大鼠痛閾升高，疼痛行為改善，提示大建中湯對內(nèi)臟痛大鼠有明顯的鎮(zhèn)痛作用。實驗中40 mmHg壓力下AWR評分，大建中湯組優(yōu)于匹維溴銨組，這可能與大建中湯的多靶點鎮(zhèn)痛作用有關(guān)。前期研究中[11]，課題組發(fā)現(xiàn)大建中湯可通過抑制神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺(5-HT)產(chǎn)生和釋放，下調(diào)神經(jīng)遞質(zhì)5-HTP(5-羥基色氨酸)、5-HIAA(5-羥基吲哚酸)水平,從而達(dá)到鎮(zhèn)痛作用，而匹維溴銨針對上述疼痛靶點的作用尚未相關(guān)報道。

腹腔內(nèi)結(jié)直腸等器官均通過副交感盆神經(jīng)投射至脊髓腰骶段[12]，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，脊髓腰骶段傳入神經(jīng)纖維數(shù)目在IBS慢性內(nèi)臟痛大鼠模型中明顯增多，這提示脊髓腰骶段可能參加了IBS慢性內(nèi)臟痛的中樞敏化過程[13]。因此，本實驗選取IBS慢性內(nèi)臟痛模型大鼠脊髓腰骶段(L6～S2)作為研究對象。

ox42是小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性免疫標(biāo)記物，僅表達(dá)于該細(xì)胞表面上，既可以作為其活化的指標(biāo)，又可以標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠脊髓腰骶段ox42陽性表達(dá)較正常組增加(P<0.01)，大建中湯高、中、低劑量組ox42陽性表達(dá)平與模型組比較降低(P<0.01)，表明IBS內(nèi)臟痛大鼠脊髓腰骶段小膠質(zhì)細(xì)胞活化，大建中湯能夠抑制模型組大鼠脊髓腰骶段小膠質(zhì)細(xì)胞活化。研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)病理性疼痛中，小膠質(zhì)細(xì)胞和P2X4受體在脊髓背角活化明顯，這一過程很可能參與了痛敏異常的發(fā)生[16]。雖然神經(jīng)病理性痛與慢性內(nèi)臟痛發(fā)病機制有所不同，但這卻為本實驗研究IBS內(nèi)臟痛提供了新的思路。本次實驗研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠脊髓腰骶段P2X4受體比正常組表達(dá)升高(P<0.01)，且大建中湯能夠降低模型組P2X4受體表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，P2X4受體僅在小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)[17]。由此推測，很可能P2X4受體介導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞參與IBS內(nèi)臟異常痛覺的產(chǎn)生，其過度表達(dá)導(dǎo)致了IBS慢性內(nèi)臟痛敏的發(fā)生。

有研究發(fā)現(xiàn)在P2X4受體被激活后，會誘發(fā)p38MAPK蛋白激酶(p38絲裂原活化蛋白激酶)活化，從而引發(fā)細(xì)胞釋放大量的各種細(xì)胞因子，激活神經(jīng)元引起中樞痛覺高敏狀態(tài)[18]。本次實驗結(jié)果與上述研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)在IBS內(nèi)臟痛大鼠腰骶段BDNF蛋白表達(dá)比正常組有升高(P<0.01)，且大建中湯能夠抑制模型組BDNF表達(dá)。由此推測，在IBS內(nèi)臟痛時小膠質(zhì)細(xì)胞活化后釋放的BDNF很可能是上述生物活性因子之一。這與Long等[19]發(fā)現(xiàn)的外周損傷可能是通過活化小膠質(zhì)細(xì)胞上P2X4受體，使BDNF合成增加進(jìn)而誘發(fā)痛敏異常的研究結(jié)果一致。

本研究提示，在IBS內(nèi)臟痛大鼠脊髓腰骶段小膠質(zhì)細(xì)胞及其表面上P2X4受體均顯著活化，使BDNF合成和釋放增多，從而BDNF可能作用于神經(jīng)元，最終導(dǎo)致了IBS內(nèi)臟痛中樞痛覺高敏狀態(tài)。大建中湯可能通過抑制P2X4受體介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，進(jìn)而阻止小膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放BDNF，降低內(nèi)臟痛覺高敏狀態(tài)。但是BDNF在IBS內(nèi)臟痛中如何作用于神經(jīng)元，其內(nèi)臟中樞敏化機制還有待進(jìn)一步研究。