郭穎，尚永輝，鄭敏燕

咸陽師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000

碳量子點(diǎn)簡(jiǎn)稱碳點(diǎn)，是一種尺寸小于10 nm的新型熒光碳納米材料。由于具有良好的熒光特性，同時(shí)具有尺寸小、水溶性好、毒性低、生物相容性好、合成成本低等優(yōu)異性能，已成為基于熒光光譜檢測(cè)生物標(biāo)志物的新型熒光探針候選物。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，碳點(diǎn)已經(jīng)在生物傳感、環(huán)境監(jiān)測(cè)及生命診療等領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景[1–3]。為了將科研工作與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合，將這一前沿領(lǐng)域研究介紹給學(xué)生，我們以科研課題研究成果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了“碳量子點(diǎn)的制備及其在生物巰基化合物檢測(cè)中的應(yīng)用”這一研究型綜合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括碳點(diǎn)合成、碳點(diǎn)的表征以及基于熒光“offon”測(cè)定巰基化合物。首先以天然植物為碳源通過一步水熱法合成熒光碳點(diǎn)，再通過紫外-可見光譜、熒光光譜等對(duì)碳點(diǎn)進(jìn)行表征。再利用Cu2+可猝滅碳點(diǎn)的熒光，而在生物巰基化合物存在時(shí)碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)的現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物巰基化合物的檢測(cè)。通過本綜合實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生熟悉納米材料合成、形貌結(jié)構(gòu)表征、光學(xué)性能測(cè)試等相關(guān)原理，并掌握相關(guān)基本實(shí)驗(yàn)技能。教學(xué)實(shí)踐表明，該實(shí)驗(yàn)對(duì)學(xué)生消除科技前沿神秘感、激發(fā)學(xué)生實(shí)驗(yàn)興趣、提升學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和綜合運(yùn)用知識(shí)能力等方面效果顯著。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1) 了解碳點(diǎn)的性質(zhì)及應(yīng)用領(lǐng)域。

(2) 學(xué)習(xí)碳點(diǎn)的制備及表征方法。

(3) 熟悉熒光光譜、紫外-可見吸收光譜的原理及操作。

(4) 學(xué)習(xí)基于熒光探針“off-on”型檢測(cè)原理及方法。

2 實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。碳點(diǎn)在制備過程中除需碳源材料外，通常還需要加入鈍化劑或摻雜劑以調(diào)節(jié)碳點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和熒光性能。在此，摻雜是將碳源材料與含摻雜異元素材料進(jìn)行共合成，讓摻雜元素直接參與碳核的形成[4,5]。苜蓿和大蒜因含有豐富的碳水化合物可作為碳點(diǎn)合成的碳源材料，并且苜蓿和大蒜中氮、硫含量均較高，因此在合成碳點(diǎn)過程中可自我摻雜形成氮、硫共摻雜的碳點(diǎn)。

圖1 碳點(diǎn)的合成及其熒光檢測(cè)生物巰基化合物原理示意圖

所合成的氮及硫摻雜碳點(diǎn)具有強(qiáng)的熒光，而Cu2+的外層電子結(jié)構(gòu)是4s13d9，外圍的d軌道不是全充滿狀態(tài)，因此，加入Cu2+后，碳點(diǎn)的電子被轉(zhuǎn)移到Cu2+的d軌道上，進(jìn)而碳點(diǎn)熒光猝滅。當(dāng)向碳點(diǎn)-Cu2+體系中加入硫醇衍生物(以半胱氨酸Cys作為研究對(duì)象)后，Cys能通過絡(luò)合作用使Cu2+從碳點(diǎn)的表面被移除[6]，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度也隨之發(fā)生改變。將上述熒光強(qiáng)度變化與檢測(cè)物Cys含量相關(guān)聯(lián)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cys的檢測(cè)。

3 試劑和儀器

3.1 實(shí)驗(yàn)試劑

大蒜、苜蓿取自咸陽周邊農(nóng)田，使用前用二次蒸餾水清洗若干次。本實(shí)驗(yàn)所用其余試劑見表1，實(shí)驗(yàn)所用超純水由Milli-Q-Plus系統(tǒng)(18.2 MΩ·cm?1)提供。

表1 主要試劑

3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)驗(yàn)所用主要儀器見表2。

表2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

4 試劑和儀器

4.1 Cys溶液的配制

在分析天平上準(zhǔn)確稱取0.0351 g的Cys置于小燒杯中，加入少量蒸餾水溶解后，定容至50 mL，配制成4.0 × 10?3mol·L?1Cys標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)逐級(jí)稀釋至所需濃度。

4.2 N, S共摻雜碳點(diǎn)的制備

將切成均勻碎塊的2 g苜蓿和2 g大蒜加入到聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜內(nèi)，并加入26 mL超純水。在230 °C烘箱中恒溫加熱4 h后，自然冷卻至室溫，混合液在13000 r·min?1下離心20 min。上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液經(jīng)用截留分子量1000 Da的透析袋透析48 h后，凍干處理即可得到兩種非金屬(N, S)同時(shí)摻雜的碳點(diǎn)固體粉末，稱重并分散于超純水中，即可得到質(zhì)量濃度為2 mg·mL?1的碳點(diǎn)分散液。

4.3 紫外-可見吸收及熒光光譜測(cè)試

將2 mg·mL?1的碳點(diǎn)分散液稀釋10倍，測(cè)試其紫外-可見吸收光譜。設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫為5 nm，在350 nm–440 nm激發(fā)波長(zhǎng)范圍內(nèi)，每隔20–30 nm測(cè)試熒光發(fā)射光譜。

4.4 熒光量子產(chǎn)率測(cè)定

(1) 分別取硫酸奎寧、碳點(diǎn)溶液于比色皿，測(cè)定其紫外吸收光譜，記錄硫酸奎寧、碳點(diǎn)在380 nm處的吸光度值(AR和A)，確保該吸光度值小于0.05。(2) 以380 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在熒光分光光度計(jì)上分別獲取硫酸奎寧、碳點(diǎn)在410–600 nm范圍內(nèi)的積分熒光強(qiáng)度值(IR和I)。

4.5 熒光檢測(cè)Cys

取7支離心管，向其中依次加入100 μL碳點(diǎn)(2 mg·mL?1)、500 μL PBS (20 mmol·L?1，pH 6.0)以及20 μL Cu2+(2.5 mmol·L?1)，渦旋混勻。在室溫下反應(yīng)5 min后，再向其中分別加入10 μL不同濃度(0、1 × 10?5、1 × 10?4、2 × 10?4、4 × 10?4、7 × 10?4、1.1 × 10?3mol·L?1) Cys，之后用超純水補(bǔ)充至體積為1000 μL，渦旋混勻靜置1 min，在380 nm激發(fā)下掃描其熒光光譜。

5 結(jié)果與討論

5.1 碳點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)

圖2a為碳點(diǎn)的紫外-可見吸收及熒光最佳激發(fā)與發(fā)射光譜圖。從吸收曲線可以看出，所合成的碳點(diǎn)在紫外-可見區(qū)有強(qiáng)的吸收，在270 nm附近有特征吸收峰，對(duì)應(yīng)于C＝O鍵的n–π*躍遷[7]。此外，碳點(diǎn)還有對(duì)稱的激發(fā)和發(fā)射光譜，最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別位于380 nm和481 nm。圖2b為碳點(diǎn)在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光光譜，可以看出碳點(diǎn)在350–440 nm范圍內(nèi)有激發(fā)波長(zhǎng)依賴性行為，即碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增加而不斷降低，而且熒光發(fā)射光譜也隨之變化，逐漸紅移，呈現(xiàn)出多元激發(fā)、多元發(fā)射的光譜特性。

圖2 碳點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)

5.2 碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率測(cè)定

按照實(shí)驗(yàn)4.5方法測(cè)定出硫酸奎寧和碳點(diǎn)的AR和A值以及硫酸奎寧、碳點(diǎn)在410–600 nm范圍內(nèi)的IR和I。代入下述公式計(jì)算得到碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率為10%，相關(guān)測(cè)試數(shù)據(jù)如表3所示。式中ηR和η為溶劑的折射率，因?qū)嶒?yàn)中硫酸奎寧和碳點(diǎn)的濃度均很低，因此可忽略溶質(zhì)的影響，折射率視為一致，均為1.33[8]。

表3 碳點(diǎn)在水溶液中的熒光量子產(chǎn)率

5.3 碳點(diǎn)熒光探針檢測(cè)Cys

如圖3a所示，在沒有加入Cys時(shí)，碳點(diǎn)-Cu2+體系有較弱的熒光，說明Cu2+明顯猝滅了碳點(diǎn)熒光。隨著Cys濃度的增加，碳點(diǎn)-Cu2+的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。根據(jù)圖3a，計(jì)算出碳點(diǎn)-Cu2+體系在不同濃度Cys中的熒光恢復(fù)率F/F0(F0為碳點(diǎn)-Cu2+體系的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為碳點(diǎn)-Cu2+體系中加入Cys后的熒光強(qiáng)度)，并繪制F/F0與Cys濃度的關(guān)系曲線。如圖3b所示，隨著Cys溶液濃度增加，F(xiàn)/F0值逐漸增強(qiáng)。通過擬合獲得線性方程Y= 0.032X+ 1.1，相關(guān)系數(shù)R= 0.9958，說明在該濃度范圍內(nèi)，碳點(diǎn)恢復(fù)的熒光與Cys濃度呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)公式LOD = 3σ/k計(jì)算檢測(cè)限為8.6 × 10?8mol·L?1(其中LOD為檢測(cè)限，σ為測(cè)定11次空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差值，k為線性方程的斜率)。因此，基于這種熒光強(qiáng)度的變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cys的檢測(cè)。

圖3 (a) 碳點(diǎn)對(duì)不同濃度Cys的熒光光譜圖；(b) F/F0與Cys濃度的關(guān)系曲線

6 思考題

(1) 哪些因素會(huì)影響碳點(diǎn)的熒光性質(zhì)？為什么？

(2) 采用參比法測(cè)定熒光量子產(chǎn)率時(shí)，為什么要求公式中AR和A值要小于0.05？

(3) 碳點(diǎn)納米探針用于生物分子檢測(cè)，有何優(yōu)點(diǎn)？

(4) 相比于熒光淬滅型檢測(cè)，碳點(diǎn)熒光“off-on”型檢測(cè)有什么優(yōu)點(diǎn)？

7 實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)及教學(xué)組織運(yùn)行方式

7.1 實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)

(1) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容綜合性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容結(jié)合學(xué)科前沿，涉及到多種方法原理和大型儀器的綜合運(yùn)用：碳點(diǎn)的合成、碳點(diǎn)的紫外及熒光光譜性能測(cè)試。通過綜合運(yùn)用這些方法原理及儀器設(shè)備能使學(xué)生對(duì)所學(xué)的大學(xué)化學(xué)知識(shí)融會(huì)貫通。

(2) 增強(qiáng)學(xué)生的科學(xué)研究意識(shí)。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容來源于教師的科研項(xiàng)目成果，通過讓學(xué)生參與到實(shí)驗(yàn)所有環(huán)節(jié)，既能培養(yǎng)學(xué)生進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研獲取信息的能力，同時(shí)也能使學(xué)生領(lǐng)悟到科學(xué)探索和研究的方法，培養(yǎng)了學(xué)生獨(dú)立、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲袘B(tài)度。

7.2 教學(xué)組織運(yùn)行方式

本實(shí)驗(yàn)是一個(gè)涉及碳點(diǎn)的合成、表征及應(yīng)用等內(nèi)容的綜合實(shí)驗(yàn)，面向化學(xué)專業(yè)3年級(jí)本科生開設(shè)，是一個(gè)開放性興趣實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用小班開課方式，每班16人左右，4人一組，實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)為16學(xué)時(shí)。分為三個(gè)階段進(jìn)行。第一階段：實(shí)驗(yàn)前教師引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研，要求學(xué)生課前先查找資料，熟悉碳點(diǎn)的制備及巰基化合物檢測(cè)的背景知識(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果討論匯報(bào)實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)方案，此階段學(xué)時(shí)數(shù)為2學(xué)時(shí)。第二階段：碳點(diǎn)的制備、熒光量子產(chǎn)率測(cè)定以及紫外、熒光光譜表征，此階段需10學(xué)時(shí)。按照以下學(xué)時(shí)分配分別完成相應(yīng)兩個(gè)單元實(shí)驗(yàn)。第一單元，碳點(diǎn)制備，計(jì)劃學(xué)時(shí)3學(xué)時(shí)。碳點(diǎn)制備需在實(shí)驗(yàn)課前一天由學(xué)生準(zhǔn)備好制備碳點(diǎn)的反應(yīng)前驅(qū)體，在教師指導(dǎo)、示范下讓學(xué)生將反應(yīng)物裝入反應(yīng)釜，升溫至實(shí)驗(yàn)所需溫度，期間有實(shí)驗(yàn)員老師在實(shí)驗(yàn)室值守(1學(xué)時(shí))，特別注意恒溫箱處于正常工作狀態(tài)。待溫度降至室溫后，由學(xué)生將反應(yīng)釜移出烘箱，用2個(gè)學(xué)時(shí)進(jìn)行碳點(diǎn)的純化及冷凍干燥處理，48 h透析期間，學(xué)生需每隔約12 h換一次水，在換水約定時(shí)間實(shí)驗(yàn)員老師在場(chǎng)。第二單元，碳點(diǎn)的表征部分，計(jì)劃7個(gè)學(xué)時(shí)，其中碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率測(cè)試3學(xué)時(shí)，紫外-可見吸收光譜及熒光光譜測(cè)試各2學(xué)時(shí)。分兩個(gè)小組每組交叉進(jìn)行兩個(gè)單元實(shí)驗(yàn)，分別由兩名教師指導(dǎo)學(xué)生實(shí)驗(yàn)。第三階段：碳點(diǎn)檢測(cè)Cys，此階段需4學(xué)時(shí)。實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，以啟發(fā)式引導(dǎo)學(xué)習(xí)基于熒光探針“off-on”型檢測(cè)原理及方法。

8 實(shí)驗(yàn)安全規(guī)范培訓(xùn)

本實(shí)驗(yàn)涉及水熱合成和高速離心分離等操作，有必要專門就此進(jìn)行有關(guān)安全規(guī)范培訓(xùn)。其主要包括以下內(nèi)容：

(1) 高速離心及使用的相關(guān)規(guī)范培訓(xùn)。

離心機(jī)使用前必須檢查面板上的各按鈕是否處于規(guī)定的位置上，檢查其他部位有無松動(dòng)及不正常情況；使用前必須檢查離心管是否有裂紋、老化等現(xiàn)象，如有應(yīng)及時(shí)更換；每支試管中放置等量樣品，對(duì)稱放入轉(zhuǎn)鼓內(nèi)，以免由于重量不均及不對(duì)稱放置引起離心機(jī)激烈振動(dòng)；離心機(jī)在高速旋轉(zhuǎn)時(shí)切不可打開蓋門；使用完畢，將轉(zhuǎn)鼓和儀器搽拭干凈，以防試液玷污而產(chǎn)生腐蝕。

(2) 恒溫烘箱相關(guān)使用規(guī)范。

認(rèn)真檢查恒溫箱自動(dòng)控制系統(tǒng)是否正常，嚴(yán)禁使用線路老化、存在隱患的溫度傳感器及繼電器的恒溫箱；最好使用具有運(yùn)行自檢功能的恒溫箱，在發(fā)生異常時(shí)能夠自動(dòng)斷電保護(hù)。

(3) 有關(guān)反應(yīng)釜使用的相關(guān)規(guī)范培訓(xùn)。

認(rèn)真檢查反應(yīng)釜，不能存在任何程度的細(xì)微裂縫；確保反應(yīng)釜體下墊片位置正確(凸起面向下)，然后放入聚四氟乙烯襯套和上墊片，先擰緊釜蓋，再用螺桿將釜蓋旋鈕擰緊為止；將反應(yīng)釜置于烘箱內(nèi)，要按規(guī)定的升溫速率升溫至所需反應(yīng)溫度(切勿高出反應(yīng)釜耐壓的安全范圍)；確保反應(yīng)釜內(nèi)溫度低于反應(yīng)體系沸點(diǎn)后，方可打開釜蓋進(jìn)行后續(xù)操作。

9 結(jié)語

本文設(shè)計(jì)了一個(gè)分析化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)。以混雜生物量為原料，通過水熱法合成了一種非金屬摻雜的熒光碳點(diǎn)。并利用Cu2+可以有效猝滅該碳點(diǎn)的熒光，在加入Cys后，由于Cys與Cu2+的絡(luò)合，阻礙了Cu2+對(duì)碳點(diǎn)熒光的猝滅，碳點(diǎn)熒光得以恢復(fù)。利用這一性質(zhì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cys的“off-on”熒光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)緊跟前沿?zé)狳c(diǎn)，內(nèi)容豐富、綜合性強(qiáng)，所制備的碳點(diǎn)應(yīng)用廣泛，與化工學(xué)院多個(gè)專業(yè)聯(lián)系緊密，適合于不同專業(yè)的學(xué)生。本實(shí)驗(yàn)的開設(shè)使學(xué)生熟悉了納米材料的制備及表征手段以及生物分子檢測(cè)過程的基本研究手段，有助于激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和創(chuàng)新能力，培養(yǎng)學(xué)生的綜合科研能力。