姚李祥 潘春柳 王春麗 李瑩 黃寶優(yōu) 黃雪彥 唐程姣 余麗瑩

摘要：通過比較不同種質(zhì)來源白芨多個成分指標(biāo)的差異，尋找影響白芨品質(zhì)的重要指標(biāo)及其相關(guān)性，為白芨的種源選擇提供參考。收集17份白芨種質(zhì)，采用紫外分光光度計法測定不同種質(zhì)白芨的多糖、蛋白質(zhì)、可溶性糖、淀粉、蔗糖、果糖及還原糖含量;利用SPSS軟件對各成分含量進(jìn)行比較分析，找出不同指標(biāo)成分間的相關(guān)性，以此來比較不同白芨種質(zhì)的品質(zhì)差異及積累規(guī)律。結(jié)果表明，不同種質(zhì)來源的白芨各成分含量存在顯著性差異，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，蔗糖含量與果糖含量呈顯著正相關(guān)性（r=0.985）;可溶性糖含量與淀粉含量具有相對較強的相關(guān)性（r=0.568）;多糖含量與淀粉含量之間呈較弱的正相關(guān)性（r=0.481），而蛋白質(zhì)含量與可溶性糖含量之間呈較弱的負(fù)相關(guān)性（r=-0.495）。由此可見，不同種質(zhì)來源的白芨塊莖中各成分含量存在明顯差異，其中果糖與蔗糖積累量具有很高的協(xié)同性，可溶性糖含量與淀粉積累量也具有一定的協(xié)同性。盡管多糖含量與淀粉含量之間的正相關(guān)性較弱，但是由于其具有一定的統(tǒng)計學(xué)意義，因此可以考慮將淀粉含量作為白芨質(zhì)量評價的候選指標(biāo)。研究結(jié)果可為白芨優(yōu)良種質(zhì)的篩選和培育提供參考。

關(guān)鍵詞：白芨;多糖;含量測定;相關(guān)性分析

中圖分類號： S567.23+9.024? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0150-05

收稿日期：2020-11-26

基金項目：廣西科技基地和人才專項（編號：桂科AD17129020）;中央本級重大增減支項目（編號：2060302-1605-03）;中央本級重大增減支項目（編號：2060302）。

作者簡介：姚李祥（1993—），男，廣西玉林人，碩士，研究方向為藥用植物種質(zhì)資源收集保存研究。E-mail：1528190924@qq.com。

通信作者：余麗瑩，女，碩士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向為藥用植物種質(zhì)資源收集保存研究。E-mail：214412619@qq.com。

白芨[Bletilla striata （Thunb.） Reichb.f.]為蘭科白芨屬多年生草本植物，以其干燥塊莖入藥，具有收斂止血、消腫生肌的功效，可用于治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒和皮膚皸裂[1]，是一種常用的中藥材。白芨的主要化學(xué)成分為聯(lián)芐類、聯(lián)菲類及其衍生物、糖苷類、萜類、多糖等[2-3]，其中多糖是白芨的主要活性成分，具有抗菌[4]、抗腫瘤[5]、促進(jìn)凝血[6]、抗氧化[7]等作用，應(yīng)用前景廣闊。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，白芨多糖對小鼠的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用[8]，對小鼠急性乙醇性肝損傷具有保護(hù)作用[9]。白芨在我國湖北、浙江、四川、貴州、廣西、安徽等地均有栽培，然而產(chǎn)量低、病害嚴(yán)重、品種退化等問題制約著白芨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。白芨生長周期較長，篩選和培育高多糖含量的白芨種質(zhì)是白芨高產(chǎn)栽培的關(guān)鍵。張新秦等對貴州地區(qū)產(chǎn)的白芨藥材進(jìn)行多糖、浸出物和總酚含量測定發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地白芨間的品質(zhì)差異較大[10]。蘇澤春等基于抗病性及田間綜合表現(xiàn)，采用灰色關(guān)聯(lián)度和Topsis評價法對白芨進(jìn)行綜合評價，認(rèn)為Topsis法評價結(jié)果中Ci值的差異適用于白芨種質(zhì)優(yōu)劣評價[11]。林立等研究發(fā)現(xiàn)，白芨野生品及栽培品塊莖中多種成分含量具有顯著差異，并認(rèn)為產(chǎn)地是影響白芨有效成分含量的最重要因素[12]。歷版《中華人民共和國藥典》中收載白芨藥材基源植物都為蘭科白芨，其有效成分含量是影響其藥材質(zhì)量及用藥安全、有效性的重要因素。目前，對白芨的研究多集中在資源分布、藥理作用、成分提取及含量測定方法等方面[13-15]，盡管目前已開展白芨不同種質(zhì)多糖含量差異的研究，但仍缺乏對白芨內(nèi)在多個成分指標(biāo)的測定及評價。本研究采用紫外分光光度計法對不同種質(zhì)來源的白芨進(jìn)行多糖、蛋白質(zhì)、可溶性糖、淀粉含量等指標(biāo)的測定，比較分析不同種質(zhì)來源白芨各成分含量之間的差異及相關(guān)性，研究結(jié)果可為篩選優(yōu)良白芨種質(zhì)、培育優(yōu)質(zhì)種子種苗提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

17份白芨種質(zhì)來源于廣西、云南、貴州、浙江等地，詳見表1。所有種質(zhì)均于2018年9月種植于廣西藥用植物園種質(zhì)圃，種植條件及管理方法均相同。所有種質(zhì)均由廣西藥用植物園余麗瑩研究員鑒定為蘭科植物白芨。2019年11月，在每份種質(zhì)中隨機選取生長情況較為相近的植株10株，挖取塊莖后用清水沖洗干凈，取部分鮮品（約2～4 g）用液氮速凍，保存于超低溫冰箱中，用于蛋白質(zhì)含量的測定。將其余樣本切成薄片后烘干、打粉后過60目篩，用于其他指標(biāo)的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖含量的測定 參照朱新焰等的方法[16]進(jìn)行白芨多糖的提取及含量測定。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定 參考李合生等的方法[17]提取白芨中的蛋白質(zhì)。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 可溶性糖含量的測定 參考李合生等的方法[17]，采用蒽酮比色法測定白芨中的可溶性糖含量。

1.2.4 淀粉含量的測定 在測定可溶性糖的離心管殘渣中加入8 mL鹽酸，沸水浴45 min，將其連同殘渣全部移至50 mL容量瓶中，加入8 mL氫氧化鈉，加水定容至刻度，離心后取上清作為待測液。取0.1 mL待測液于干凈的試管中，加入0.9 mL水、4.0 mL蒽酮-硫酸試劑，沸水浴顯色5 min，測定D620 nm。以葡萄糖為對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中的淀粉含量。

1.2.5蔗糖含量的測定? 參考李合生等的方法[17]并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。精確稱取50 mg樣品粉末，置于 50 mL 離心管中，加入20 mL 80%乙醇，于80 ℃水浴加熱30 min，冷卻后離心，取上清。向殘渣中加入 20 mL 80%乙醇，再次提取，合并2次提取的上清液。向上清液中加入0.2 g活性炭，80 ℃水浴脫色30 min，過濾，濾液用80%乙醇定容至50 mL，作為待測液。取1.0 mL待測液，加入0.2 mL 2 mol/L氫氧化鈉混勻，沸水浴5 min，冷卻后加入2.8 mL 30%鹽酸及0.1 mL間苯二酚試劑混勻，于80 ℃水浴 10 min，冷卻后測D480 nm。根據(jù)蔗糖對照的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中的蔗糖含量。

1.2.6 果糖含量測定 待測溶液的制備方法同“1.2.5”節(jié)。準(zhǔn)確吸取0.5 mL待測液于干凈試管中，加入0.5 mL 80%乙醇、2.8 mL 30%鹽酸、0.8 mL 0.1%間苯二酚混勻。于80 ℃水浴10 min，冷卻后測定D480 nm。根據(jù)果糖對照的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算樣品中的蔗糖含量。

1.2.7 還原糖含量測定 參考李志霞等的方法[18]并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。精確稱取1 g樣品粉末置于 50 mL 離心管中，加入30 mL蒸餾水混勻，于50 ℃水浴20 min，邊水浴邊攪拌，使樣品粉末中的還原糖充分浸出，待其微冷后離心，轉(zhuǎn)移上清液，在沉淀中加入15 mL水，攪拌充分，再次離心，合并上清液，加入適量活性炭，在80 ℃水浴鍋中水浴脫色，過濾，濾液加水定容到50 mL，作為待測液。取0.5 mL待測液，加入0.5 mL蒸餾水、3 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，沸水浴5 min，冷卻后測定D540 nm。根據(jù)還原糖對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中的還原糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同白芨種質(zhì)的多糖含量比較

多糖為白芨藥材的主要活性成分，具有多種藥理作用，是評價白芨品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。由圖1可見，不同白芨種質(zhì)的多糖含量為89.4～232.1 mg/g，含量差異較大。其中2號白芨種質(zhì)的多糖含量最高，其次為16、17號種質(zhì)，7號種質(zhì)的多糖含量最低。利用SPSS軟件進(jìn)行方差分析的結(jié)果表明，2號白芨種質(zhì)的多糖含量顯著高于其余16份白芨種質(zhì)（P<0.05），1、3、6、11、15號白芨種質(zhì)之間的多糖含量沒有顯著性差異。

2.2 不同白芨種質(zhì)的蛋白質(zhì)含量比較

由圖2可見，不同白芨種質(zhì)塊莖中的蛋白質(zhì)含量差異較大，1號種質(zhì)的蛋白質(zhì)含量顯著高于其他種質(zhì)。蛋白質(zhì)含量較高的種質(zhì)還包括3、13、17號，7、14號種質(zhì)的蛋白質(zhì)含量最低。利用SPSS軟件進(jìn)行方差分析的結(jié)果表明，3、13、17號種質(zhì)的蛋白質(zhì)含量間無顯著性差異。

2.3 不同白芨種質(zhì)的可溶性糖含量比較

由圖3可以看出，不同白芨種質(zhì)塊莖中的可溶性糖含量為109.8～213.6 mg/g，存在較大差異。其中，12號種質(zhì)的可溶性糖含量明顯高于其他種質(zhì)，達(dá)到213.6.4 mg/g;7、16號種質(zhì)的可溶性糖含量也較高，方差分析結(jié)果顯示它們之間無顯著差異;4、5號種質(zhì)的可溶性糖含量較低。

2.4 不同白芨種質(zhì)的淀粉含量比較

由圖4可知，不同種質(zhì)白芨塊莖中的淀粉含量為30.5～264.7 mg/g，差異較大。其中12號種質(zhì)的淀粉含量最高，其次為16號;15、17號種質(zhì)的淀粉含量也較高，方差分析結(jié)果顯示它們之間無顯著性差異;淀粉含量最低的種質(zhì)為5號，與12號種質(zhì)間的淀粉含量相差234.2 mg/g;其他種質(zhì)（如2、4、10、13號）的淀粉含量也相對較低。

2.5 不同白芨種質(zhì)的蔗糖含量

由圖5可以看出，不同種質(zhì)來源白芨塊莖中的蔗糖含量以9號最高，為62.5 mg/g，其余種質(zhì)的蔗糖含量均明顯較低;16號種質(zhì)的蔗糖含量最低，僅18.9mg/g，此外，5、12、17號種質(zhì)的蔗糖含量也較低。

2.6 不同白芨種質(zhì)的果糖含量比較

由圖6可以看出，9號白芨種質(zhì)的果糖含量最高，為36.8 mg/g，其次為2號種質(zhì)，果糖含量為24.7 mg/g，其余種質(zhì)的果糖含量均明顯低于這2個種質(zhì)。16、17號種質(zhì)的果糖含量較低，分別僅為9.7、9.0 mg/g，方差分析結(jié)果顯示，它們之間無顯著性差異。

2.7 不同白芨種質(zhì)的還原糖含量比較

由圖7可以看出，不同種質(zhì)白芨塊莖中的還原糖含量存在較大差異。其中，17號種質(zhì)的還原糖含量最高，為79.7 mg/g，8號種質(zhì)的還原糖含量也較高。方差分析結(jié)果表明，除1、3、16號種質(zhì)，7、12號種質(zhì)以外，其他種質(zhì)來源的白芨還原糖含量之間均具有顯著性差異。

2.8 不同測定指標(biāo)間的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步了解不同測定指標(biāo)之間的關(guān)系，利用SPSS軟件對各測定指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。由表2可以看出，果糖含量與蔗糖含量具有強正相關(guān)性（r=0.985），說明白芨塊莖中果糖與蔗糖的積累具有較高的一致性;可溶性糖含量與淀粉含量之間也有較強的正相關(guān)性（r=0.568）;多糖含量與淀粉含量的積累具有較弱的正相關(guān)性（r=0.481）;此外，蛋白質(zhì)含量與可溶性糖含量之間具有較弱的負(fù)相關(guān)性（r=-0.495），其相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明2個變量之間可能存在一定的聯(lián)系。

3 結(jié)論與討論

對17份不同種質(zhì)來源的白芨進(jìn)行多糖、蛋白質(zhì)、可溶性糖、淀粉、蔗糖、果糖及還原糖含量測定發(fā)現(xiàn)，白芨塊莖中各成分含量存在很大差異，其中淀粉含量變化范圍最大，最高淀粉含量與最低淀粉含量間相差234.2 mg/g。多糖是白芨的主要活性成分之一，多糖含量是評價白芨藥材最重要的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，來自廣西壯族自治區(qū)靖西市靖西藥市的白芨多糖含量最高，其次為廣西巴馬瑤族自治縣的白芨種質(zhì)，而來自廣西壯族自治區(qū)桂林市全州縣的白芨種質(zhì)的多糖含量最低。由于本研究中的17份白芨種質(zhì)均在相同地塊中種植，培育時間及管理方式一致，因此，通過比較不同種質(zhì)來源白芨塊莖中多糖含量的差異，對于白芨優(yōu)良種質(zhì)選擇及良種繁育來說具有一定的指導(dǎo)意義。廣西是白芨主產(chǎn)區(qū)之一，為了確保白芨藥材優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)，應(yīng)重視白芨的種質(zhì)來源，宜選擇多糖含量較高的種質(zhì)（如靖西或巴馬種質(zhì)）進(jìn)行推廣種植。

研究發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)來源的白芨塊莖內(nèi)大量元素（N、Zn、Mn）含量之間呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，但多糖的累積不受大量元素和微量元素的影響，初生代謝產(chǎn)物與礦質(zhì)元素之間不具有協(xié)同作用[12]。本研究對白芨各測定指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)來源白芨塊莖中果糖含量與蔗糖含量之間具有強正相關(guān)性，表明白芨塊莖在初生代謝物形成過程中伴隨著果糖與蔗糖的協(xié)同性積累。可溶性糖含量與淀粉含量之間呈較強的正相關(guān)性，表明白芨塊莖中可溶性糖的累積與淀粉也具有一定的協(xié)同性，其原因可能與可溶性糖累積為淀粉合成提供充足的底物有關(guān)。此外，多糖含量與淀粉含量之間呈較弱的正相關(guān)性。淀粉為單糖組成的多糖，在白芨塊莖多糖積累的過程中，淀粉可能是多糖的主要貯存形式之一。由于多糖含量與淀粉含量之間的相關(guān)性具有一定的統(tǒng)計學(xué)意義，可考慮將淀粉含量作為評價白芨種質(zhì)優(yōu)劣的候選指標(biāo)。

本研究對不同種質(zhì)來源白芨塊莖中的多個成分含量指標(biāo)進(jìn)行了測定，比較了各成分指標(biāo)的差異及其相關(guān)性，為白芨優(yōu)良種質(zhì)篩選及培育提供數(shù)據(jù)支持。

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