周德祥

天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院(天津中醫(yī)藥大學(xué)第四附屬醫(yī)院)病理科 (天津 300451)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常見的一種惡性腫瘤，近年來發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率和死亡率均出現(xiàn)上升趨勢[1-2]。2018年流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，歐洲新發(fā)結(jié)直腸癌病例約為38.8萬例，結(jié)直腸癌相關(guān)死亡病例約為17.4萬例，而我國每年約有超過25萬例新增病例和14萬例結(jié)直腸癌相關(guān)死亡病例[3]。2019年，我國國家癌癥中心公布的全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在所有惡性腫瘤里，CRC的發(fā)病率排列在第3位，死亡率排列在第5位，嚴(yán)重危害著公眾的生命健康[4]。

目前，結(jié)直腸癌的發(fā)生主要以正常黏膜-息肉-腺瘤伴癌前病變-癌變演變進(jìn)程為主，這種演變主要分為增生性息肉(hyperplastic poly，HP)、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤(sessile serrate adenoma/poly，SSA/P)、傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma，TSA)和鋸齒狀腺癌(serrated adenocarcinoma，SA)[5]。其中，無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤可能通過鋸齒狀通路發(fā)生癌變，這種癌變與錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)缺陷導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)有較大的相關(guān)性。微衛(wèi)星不穩(wěn)定主要與MMR蛋白表達(dá)異常相關(guān)，研究顯示錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1是結(jié)直腸癌發(fā)生的主要相關(guān)蛋白，如果表達(dá)異常會(huì)使得結(jié)直腸癌的患病概率大大提高[6]。

此外，細(xì)胞角蛋白20(CK20)是一種中間絲蛋白，其表達(dá)具有嚴(yán)格的上皮組織特異性，可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤程度有一定的關(guān)系，有研究者提出CK20可作為檢測結(jié)直腸癌的一種腫瘤分子標(biāo)志物[7]。CRC早期診斷和判斷預(yù)后的分子指標(biāo)對于提高CRC患者的生存率、改善患者生存質(zhì)量以及降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)都至關(guān)重要。本研究采用免疫組化方法檢測結(jié)直腸癌癌前病變組織樣本以及結(jié)直腸癌組織樣本中MLH1和CK20的表達(dá)，分析其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床病理特征，同時(shí)也為早期發(fā)現(xiàn)高?；疾∪巳阂约敖Y(jié)直腸癌的臨床治療和預(yù)后提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2019年1月至2020年12月我院經(jīng)手術(shù)完整切除的結(jié)直腸病變組織學(xué)標(biāo)本，根據(jù)2010版WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重新分類[5]，由資深病理醫(yī)生對于標(biāo)本共同進(jìn)行確認(rèn)，最終篩選出鋸齒狀病變組織樣本80例，其中男性和女性分別為50例和30例，年齡25～81歲，中位年齡62歲。根據(jù)組織學(xué)分類，其中增生性息肉(HP)、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤(SSA/P)和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(TSA)分別為39例、16例和25例，并收集結(jié)腸鏡檢及相關(guān)臨床資料。

此外還收集了我院2016年1月至2020年12月確診的結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標(biāo)本48例，其中男性和女性分別為27例和21例，年齡48～83歲，中位年齡62歲。每個(gè)患者病理切片均經(jīng)病理醫(yī)生確診為CRC，其中高分化、中分化和低分化CRC患者分別為8例、31例和9例；臨床分期：Ⅰ期患者有5例，Ⅱ期患者有23例，Ⅲ期患者有16例，Ⅳ期患者有4例，所有患者的臨床資料保留均較完整。

1.2 方法所有標(biāo)本均由10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，采用免疫組化MaxVision二步法檢測樣本中MLH1和CK20的表達(dá)水平。對于石蠟標(biāo)本切片，采用血清室溫封閉，然后分別加入MLH和CK20一抗孵育，再加二抗孵育，上述每個(gè)步驟均用PBS清洗3次，每次清洗5min，之后通過DAB顯色，蘇木素復(fù)染，然后常規(guī)脫水、透明、封片，最后進(jìn)行觀察。MLH1抗體試劑購自福州邁新公司，CK20抗體試劑購自中杉金橋生物。

1.3 結(jié)果判定根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率分析MLH1和CK20表達(dá)水平。染色判定標(biāo)準(zhǔn)為：無著色，陰性0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色，陽性3分。陽性細(xì)胞百分率的判定標(biāo)準(zhǔn)為：≤10%(0分)，10%～25%(1分)，25%～50%(2分)，50%～75%(3分)，＞75%(4分)。陽性表達(dá)的判斷：染色評分與陽性細(xì)胞數(shù)相乘≥2分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對研究結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在80例結(jié)直腸癌前變組織標(biāo)本中，增生性息肉(HP)、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤(SSA/P)和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(TSA)分別為39例、16例和25例。MLH-1蛋白陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，在HP、SSA/P和TSA中錯(cuò)配修復(fù)基因MLH-1蛋白表達(dá)率在分別為97.4%(38/39)、75.0%(12/16)和64.0%(16/25)，見表1。

表1 結(jié)直腸癌前病變組織中錯(cuò)配修復(fù)基因ML1的蛋白表達(dá)情況

表1 結(jié)直腸癌前病變組織中錯(cuò)配修復(fù)基因ML1的蛋白表達(dá)情況

類型 例數(shù) MLH1[n(%)]表達(dá) 缺失增生性息肉 39 38(97.4) 1(2.6)無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤 16 12(75.0) 4(25.0)傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤 25 16(64.0) 9(36.0)

2.2 結(jié)直腸癌前病變組織中CK20蛋白表達(dá)率如表2所示，在HP、SSA/P和TSA組織樣本中，CK20的表達(dá)的陽性率分別為20.5%(8/39)、56.2%(9/16)和72.0%(18/25)，呈逐漸上升趨勢。

表2 結(jié)直腸癌前病變組織中CK20的蛋白表達(dá)情況

對48例CRC組織標(biāo)本通過免疫組化方法對MLH1蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示有17例患者存在MLH1蛋白表達(dá)缺失，其中男性患者9例，女性患者8例，MLH1整體蛋白表達(dá)缺失率為35.4%(17/48)。在CRC組織中，患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期對MLH1蛋白表達(dá)缺失沒有影響(P＞0.05)，MLH1蛋白表達(dá)缺失主要與分化程度有關(guān)。在低分化腺癌患者中，MSH1表達(dá)缺失明顯高于中分化和高分化腺癌患者(P＜0.05)，表明細(xì)胞分化程度較低的結(jié)直腸癌患者更易發(fā)生MLH1蛋白表達(dá)缺失，見表3。

表3 在結(jié)直腸癌組織中ML1的表達(dá)情況

表3 在結(jié)直腸癌組織中ML1的表達(dá)情況

臨床特征 例數(shù) MLH1[n(%)] P缺失 表達(dá)性別 男 27 9(33.3) 18(66.7) 0.859女 21 8(38.1) 13(61.9)年齡 ＜60 26 9(34.6) 17(65.4) 0.747≥60 22 8(36.4) 14(63.6)分化程度 高分化 8 2(25.0) 6(75.0) ＜0.001中分化 31 10(32.3) 21(67.7)低分化 9 5(55.6) 4(44.4)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有 16 6(37.5) 10(62.5) 0.761無 32 11(34.4) 22(65.6)TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期 28 9(32.1) 19(67.9) 0.296Ⅲ～Ⅳ期 20 8(40.0) 13(60.0)

2.4 CRC組織中CK20表達(dá)率與臨床病理特征的關(guān)系在收集的48例CRC患者組織標(biāo)本中，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)CK20的陽性表達(dá)率為89.6%(43/48)，患者性別、年齡以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不影響CK20的表達(dá)水平(P＞0.05)，CK20的表達(dá)水平主要與分化程度有關(guān)。低分化CRC患者CK20表達(dá)水平為100%(9/9)，中分化CRC患者CK20表達(dá)水平為90.3%(28/31)，高分化的CRC患者CK20表達(dá)水平為75%(6/8)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 在結(jié)直腸癌組織中CK20的表達(dá)情況

3 討 論

結(jié)直腸癌是胃腸道系統(tǒng)中的一種異質(zhì)性惡性腫瘤，它的發(fā)生與多種因素，比如生活方式(吸煙、飲酒等)、飲食結(jié)構(gòu)等生活因素以及環(huán)境因素、遺傳因素等有關(guān)，這些因素均可引起多基因的改變。正常人體內(nèi)都有著一套非常完善的DNA錯(cuò)配修復(fù)體系，它可以防止DNA在復(fù)制的過程中出現(xiàn)異常或者缺失，從而保證細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性和完整性[8-9]。然而，當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)蛋白出現(xiàn)突變或缺失時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的DNA序列會(huì)出現(xiàn)增多或丟失，從而引起細(xì)胞出現(xiàn)突變或癌變[10]。

結(jié)直腸癌變中的鋸齒狀癌變通路是近年來提出的一條新的癌變途徑，在鋸齒狀癌變通路中，錯(cuò)配修復(fù)(MMR)基因表達(dá)缺失發(fā)揮著重要的作用[11]。錯(cuò)配修復(fù)基因包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等，其中MLH1發(fā)揮主要的作用。近年來在結(jié)直腸癌中關(guān)于MLH-1的研究逐漸開始增多，而在結(jié)直腸癌變中的研究卻并不多。本研究通過免疫組化方法檢測了增生性息肉、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤組織中MLH-1蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在增生性息肉、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤組織中MLH1表達(dá)率分別為97.4%、75.0%和64.0%，呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，故推測MLH-1基因的表達(dá)與結(jié)直腸鋸齒狀癌變通路具有一定的相關(guān)性，隨著癌變程度的加劇，MLH1缺失率依次遞增。此外，本研究還對48例CRC組織標(biāo)本進(jìn)行MLH1蛋白表達(dá)的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有17例患者存在MLH1的表達(dá)缺失，MLH1蛋白表達(dá)缺失率為35.4%。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期對MLH1蛋白表達(dá)缺失沒有影響(P＞0.05)，MLH1蛋白表達(dá)缺失主要與分化程度有關(guān)(P＞0.05)，分化程度越低，越容易出現(xiàn)MLH1蛋白表達(dá)的缺失。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，早期結(jié)直腸癌患者的5年生存率可以達(dá)到將近90%，但多數(shù)結(jié)直腸癌患者確診時(shí)已到中晚期，對于晚期的患者，生存率顯著下降[12]。因此，鑒別結(jié)直腸癌前病變是早期預(yù)防結(jié)直腸癌的關(guān)鍵，特別是早期識別可以發(fā)展為癌的無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤更加重要，繼而在病變發(fā)生發(fā)展的早期階段進(jìn)行干預(yù)，從而達(dá)到早期預(yù)防和治療的目的。CK20是分布于上皮細(xì)胞中間纖維絲的多肽，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)惡化增殖時(shí)，CK20呈現(xiàn)高強(qiáng)度的表達(dá)狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，在無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤組織樣本中，CK20表達(dá)率明顯較高；而在增生性息肉中，CK20的表達(dá)率相對較低，提示增生性息肉與無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤具有不同的分子生物學(xué)進(jìn)程，無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤有很大可能向腫瘤方面演變。在48例CRC患者組織標(biāo)本中，CK20的陽性表達(dá)率為89.6%，在分化程度較高的CRC患者組織中CK20的表達(dá)率均較高，這提示CK20可能為結(jié)直腸癌發(fā)病的關(guān)鍵基因之一，參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲的整個(gè)過程。

綜上所述，檢測錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1和CK20在結(jié)直腸癌前病變與結(jié)直腸癌中的表達(dá)對于判斷疾病進(jìn)展，疾病病情、疾病治療和疾病預(yù)后方面都有很重要的價(jià)值。通過早期篩查錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1及CK20的表達(dá)情況，評估患者的病情狀況，降低癌變的發(fā)生，改善患者預(yù)后。