孟 園 李 平 劉 欣 袁 晶

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

高血壓是臨床常見的心血管疾病，在全國乃至全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率占較大比例，易合并腦血管意外、認(rèn)知障礙、糖尿病等，極大地增加了社會(huì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)其還是心血管疾病和其他疾病的主要死因。盡管目前高血壓的防治取得了一定進(jìn)展，但仍任重而道遠(yuǎn)。高血壓的發(fā)生除了與遺傳、飲食、情志等相關(guān)外，與性別亦有重要關(guān)系，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，青年期男性發(fā)病率多高于女性，絕經(jīng)前后女性發(fā)病率趕超同年齡男性[1]，且較男性血壓更不易控制[2]，因此高血壓的防治成為國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)無“高血壓”病名，一般將其歸于“眩暈”“頭痛”及“經(jīng)斷前后諸證”范疇。二仙湯是名老中醫(yī)張伯訥教授的自創(chuàng)方，由淫羊藿、仙茅、黃柏、知母、巴戟天和當(dāng)歸組成，具有溫腎益精、滋陰瀉火的作用，能調(diào)節(jié)性腺軸功能和激素水平，改善內(nèi)分泌及心臟功能和血壓水平[3-6]。但作為中藥復(fù)方，二仙湯中的有效成分復(fù)雜、涉及的靶點(diǎn)和通路較多，難以闡明復(fù)方發(fā)揮作用的具體機(jī)制。因此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法，探索二仙湯治療高血壓的作用機(jī)制，為其治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 二仙湯有效成分、靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索二仙湯中藥物，以生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為條件篩選，并獲得各成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名。以“Hypertension”為檢索詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）和Therapeutic target database 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）檢索高血壓靶點(diǎn)。

1.2 有效成分和交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（proteinprotein interaction，PPI）的構(gòu)建

對藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建有效成分和交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。交集靶點(diǎn)上傳String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），PPI 評分設(shè)為0.7。通過Cytoscape 軟件實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化，篩選度值大于所有節(jié)點(diǎn)度值中位數(shù)兩倍的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)[7]。

1.3 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析及“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用DAVID 6.7 數(shù)據(jù)庫（https://david-d.ncifcrf.gov/）對關(guān)鍵基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，通過Cytoscape軟件建立“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”圖。

1.4 分子對接驗(yàn)證

篩選出“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”中排名靠前的靶點(diǎn)和有效成分，并下載有效成分的3D 結(jié)構(gòu)（mol2 格式），進(jìn)行加氫、加電荷、檢測配體的root、可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義等操作。下載靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并添加所有氫原子、計(jì)算Gasteiger 電荷、合并非極性氫。參數(shù)exhaustiveness 設(shè)為20，其他參數(shù)為默認(rèn)值。采用Autodock vina 1.1.2 進(jìn)行半柔性對接，并使用Pymol作圖。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯有效成分、靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP 獲得二仙湯的有效成分，其中淫羊藿23 個(gè)，仙茅7 個(gè)，巴戟天20 個(gè)，當(dāng)歸2 個(gè)，知母15 個(gè)，黃柏37 個(gè)，總靶點(diǎn)共218 個(gè)。共得到高血壓靶點(diǎn)1073 個(gè)。

2.2 活性成分和交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

共得到101 個(gè)交集靶點(diǎn)。二仙湯藥物-有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中共有294 個(gè)節(jié)點(diǎn)，933 條邊。度值最高的有效成分分別是槲皮素、山柰酚和木犀草素。PPI網(wǎng)絡(luò)中共涉及101 個(gè)節(jié)點(diǎn)，739 個(gè)PPI 關(guān)系，見圖1。篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)共20 個(gè)，其中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 的度值最高，為48。

圖1 二仙湯的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 和KEGG 富集分析及“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

GO 富集分析共得到315 個(gè)條目（P ＜0.01），其中生物過程300 個(gè)，根據(jù)P 值從小到大排列選取前20 個(gè)，主要涉及細(xì)胞凋亡、對細(xì)菌和脂多糖的反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖與一氧化氮（nitric oxide，NO）合成等。細(xì)胞組成7 個(gè)，包括胞外區(qū)、膜封閉腔、核質(zhì)及細(xì)胞器腔等。分子功能8 個(gè)，主要影響細(xì)胞因子、生長因子及蛋白激酶的活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑的活性及等，見圖2。共得到信號通路25 條（P ＜0.01），根據(jù)P 值從小到大排列選取前20 個(gè)。見圖3。構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”圖，見圖4。其中矩形為藥物，六邊形為藥物成分（圓形為共有成分），V 形為通路，菱形為靶點(diǎn)。其中涉及57 個(gè)有效成分，101 個(gè)靶點(diǎn)，25 條通路。度值較高的成分有槲皮素、山柰酚和木犀草素等，靶點(diǎn)有前列腺素內(nèi)過氧化物酶（prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS）2、PTGS1、絲裂原活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）1、Akt 激酶（Akt kinase，AKT）1 等。

圖2 GO 功能富集圖

圖4 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路圖

2.4 分子對接驗(yàn)證

根據(jù)“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)篩選出度值最高的5 個(gè)有效成分和4 個(gè)靶蛋白。結(jié)果顯示，蛋白和有效成分對接的結(jié)合能均小于-5 kJ/mol（結(jié)合能小于-5 kJ/mol 提示配體和受體結(jié)合良好），提示靶蛋白和有效成分能穩(wěn)固結(jié)合。其中PTGS2、PTGS1 分別與有效成分槲皮素、木犀草素結(jié)合最緊密，MAPK1 和AKT1 與脫水淫羊藿素結(jié)合最為密切。見圖5。

圖5 二仙湯的分子對接圖

3 討論

本研究結(jié)果提示，槲皮素、山柰酚及木犀草素等可能是二仙湯發(fā)揮作用的主要成分。研究表明，槲皮素有一定的降血壓作用[8]，其機(jī)制可能包括抗氧化、內(nèi)皮依賴性及非內(nèi)皮依賴性內(nèi)皮功能改善等[9]，此外還能通過Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）4 降低心肌纖維化程度[10]。木犀草素能升高高血壓大鼠的NO水平，降低血管緊張肽（angiotensin，Ang）Ⅱ和內(nèi)皮素-1濃度[11]，通過升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度改善腎性高血壓[12]，并下調(diào)PI3K-Akt 通路、調(diào)節(jié)MAPK 通路和抑制活性氧生成以抑制血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖和遷移[13-14]。山柰酚能通過下調(diào)MAPK 通路逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮損傷及其炎癥反應(yīng)[15]，增強(qiáng)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能[16]。PPI 網(wǎng)絡(luò)提示IL-6、AKT1及MAPK1 等在高血壓中發(fā)揮重要作用。有研究表明，IL-8、IL-6 和腫瘤壞死因子等炎癥因子可觸發(fā)正常人體中由Ang-Ⅱ引起的高血壓[17]。PTGS2 編碼的環(huán)氧合酶2 主要在炎癥因子、Ang-Ⅱ等因素刺激下誘導(dǎo)性表達(dá)，抑制其在造血細(xì)胞中的表達(dá)可促進(jìn)鹽敏感性高血壓的發(fā)生[18]。

從富集分析來看，二仙湯主要通過細(xì)胞凋亡和增殖、對細(xì)菌的反應(yīng)、NO 的合成等過程及Toll 樣受體通路、MAPK 通路、核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（nucleotide binding oligomerization domain，NOD）樣受體（NOD-like receptor，NLR）通路、促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）通路等調(diào)節(jié)血壓。TLR 在高血壓的慢性炎癥、氧化應(yīng)激及血管重塑中充當(dāng)重要角色[19]，其中Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓與TLR3-β 干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白通路的激活有關(guān)[20]。NLR 能與其他蛋白結(jié)合形成NLR 家族炎癥小體（NOD-like receptor protein，NLRP）。NLRP3 可激活高血壓中VSMC 增殖及表型轉(zhuǎn)化，敲除NLRP3 基因后上述表現(xiàn)明顯改善[21]。NO 能抑制GnRH 神經(jīng)元放電以調(diào)節(jié)GnRH 的分泌和活性，而參與合成NO 的神經(jīng)型一氧化氮合酶可能在雌激素負(fù)反饋抑制GnRH 水平中發(fā)揮了重要作用[22]。GnRH 作用于垂體前葉的G 蛋白偶聯(lián)受體，通過G 蛋白α 亞基家族介導(dǎo)MAPK 級聯(lián)的激活（包括p38MAPK及胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路）[23]。研究表明，p38MAPK通路的激活能促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化，增強(qiáng)NO 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并抑制活性氧的生成[24]。而阻斷胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號傳導(dǎo)能抑制VSMC 增殖，進(jìn)而改善血管重構(gòu)[25]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探索了二仙湯治療高血壓的可能機(jī)制，即通過槲皮素、山柰酚與木犀草素等介導(dǎo)Toll 樣受體通路、MAPK通路、NOD 樣受體通路及GnRH 通路等發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、抗炎、抑制VSMC 增殖和遷移及抗氧化等作用，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)和多通路的特點(diǎn)，為其指導(dǎo)臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為后續(xù)二仙湯治療高血壓提供了理論基礎(chǔ)，但仍需進(jìn)一步的研究和推廣。