譚曉謙 梅海波 伍江雁 嚴 安

湖南省兒童醫(yī)院骨科，湖南長沙 410007

骨肉瘤是骨腫瘤中常見的一種惡性腫瘤，具有侵襲性極高、惡性程度高、預(yù)后不良等特點，超過15%的患者在確診時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有遠處轉(zhuǎn)移[1-3]。骨肉瘤的治療主要以手術(shù)切除和手術(shù)期化療為主，其中未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者的5 年生存率高達70%，但是轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者的5 年生存率低于20%[4-5]。近年研究結(jié)果顯示，長鏈非編碼RNA 在骨肉瘤中通過參與細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程，發(fā)揮著重要的作用[6-8]。核仁小分子RNA 宿主基因3（small nucleolar RNA host gene 3，SNHG3）位于人染色體1p35.3 位置上，在多種腫瘤中異常表達。研究發(fā)現(xiàn)SNHG3 在骨肉瘤組織中高表達，與不良預(yù)后顯著相關(guān)；SNHG3 靶向作用miRNA-151a-3p 上調(diào)AB22A 表達促進骨肉瘤細胞的侵襲和遷移[9]。微小RNA（microRNA，miRNA）在多種腫瘤中起到抑癌或促癌的作用，miR-514a-5p 在多種癌細胞中表達下調(diào)，但miR-514a-5p 在骨肉瘤的作用機制尚不明確。因此，本研究探討SNHG3 通過靶向調(diào)控miR-514a-5p對骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移的作用，為骨肉瘤疾病的診斷、治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

成骨細胞hFOB1.19 和骨肉瘤細胞SW-1353、HOS、U-2OS、Saos-2 購于中國科學(xué)院上海細胞庫；胎牛血清（9735212）、DMEM 培養(yǎng)基（91249142）購于美國Gibco 公司；si-NC、si-SNHG3、miR-NC、miR-514a-5p、anti-miR-NC 和anti-miR-514a-5p 購于廣州瑞博生物公司；引物由上海吉瑪公司設(shè)計合成；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（10652-011）、Trizol 試劑盒（10153-023）購于美國Invitrogen 公司；熒光定量試劑盒（RR246B）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（452237152）購于大連Takara 公司；CCK-8 試劑盒（32021）購于日本同仁公司；凋亡試劑盒（C0948）購于碧云天生物研究所；c-Myc 抗體（3097T）、Bax 抗體（0265T）、MMP-2 抗體（4026T）購于美國CST 公司；Transwell 小室（3564314 13324）購于美國Corning 公司；Matrigel 基質(zhì)膠（3124523）購于美國BD 公司；雙熒光素酶試劑盒（D0132）購于北京索萊寶公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將成骨細胞hFOB1.19 和骨肉瘤細胞SW-1353、HOS、U-2OS、Saos-2 常規(guī)復(fù)蘇后，進行細胞培養(yǎng)，置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2中培養(yǎng)。細胞的密度融合至75%～85%時，加入胰蛋白酶消化。

取對數(shù)生長期的U-2OS 細胞，根據(jù)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，將其分為si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-SNHG3 組（轉(zhuǎn)染si-SNHG3）、miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-514a-5p 組（轉(zhuǎn)染miR-514a-5p）、si-SNHG3+anti-miR-NC 組（共轉(zhuǎn)染si-SNHG3和anti-miR-NC）和si-SNHG3+anti-miR-514a-5p 組（共轉(zhuǎn)染si-SNHG3 和anti-miR-514a-5p）。

1.3 qRT-PCR 檢測細胞中SNHG3 和miR-514a-5p表達

使用Trizol 試劑盒提取各組細胞的總RNA，在紫外分光光度計檢測RNA 濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，通過熒光定量試劑盒進行PCR 擴增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。分別以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計算SNHG3 和miR-514a-5p 的表達。SNHG3 正向引物：5’-GACTTCCGGGCACTTCGTAA-3’，反向引物：5’-TGCTCCAAGTCTGCCAAAGA-3’；GAPDH 正向引物：5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’，反向引物：5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’。miR-514a-5p正向引物：5'-TCACTACTCTGGAGAGTGACAAT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6 正向引物：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，反向引物：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.4 CCK-8 法檢測細胞活力

離心后收集沉淀的細胞，加入磷酸鹽緩沖液制備細胞懸液，接種于96 孔板中，培養(yǎng)48 h 后，在每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀及在450 nm 波長處測量吸光值。細胞活力=實驗組吸光度值/空白對照吸光度值×100%。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

取各組離心后收集的細胞，加入500 μL 結(jié)合緩沖液，通過凋亡試劑盒說明書，分別加入5 μL Annexin-V FITC 和PI 溶液，避光反應(yīng)20 min，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.6 Western blot 檢測c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表達

采用BCA 法檢測定量蛋白，同時取45 μg 的蛋白樣品在聚丙烯酰胺凝膠電泳處理后，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入相應(yīng)的一抗，過夜孵育，次日加入二抗，孵育2 h 后行顯影處理（化學(xué)發(fā)光液），GAPDH 作為內(nèi)參，采用Image J 對蛋白條帶的灰度值進行分析，計算蛋白表達。

1.7 Transwell 小室檢測細胞遷移和侵襲

1.7.1 遷移實驗 取各組細胞加入不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基內(nèi)，稀釋細胞濃度為2×105個/mL。在Transwell 小室上層加入100 μL 細胞懸液，下層加入500 μL 含10 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，從培養(yǎng)箱中取出小室，使用棉簽輕輕擦拭上層細胞，加入甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下選擇3 個視野拍照，觀察細胞數(shù)目，計數(shù)取平均值。

1.7.2 侵襲實驗 在Transwell 小室上層鋪稀釋Matrigel基質(zhì)膠，烘干后，其余步驟同“1.7.1”項下。

1.8 雙熒光素酶驗證SNHG3 與miR-514a-5p 關(guān)系

Starbase 在線數(shù)據(jù)庫顯示SNHG3 和miR-514a-5p 存在結(jié)合位點。構(gòu)建SNHG3 野生型（SNHG3 wild type，SNHG3-WT）和SNHG3 突變型（SNHG3 mutant，SNHG3-MUT）雙熒光素酶報告載體，分別轉(zhuǎn)染miRNC 和miR-514a-5p 至U-2OS 細胞。轉(zhuǎn)染48 h，采用雙熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG3 和miR-514a-5p 在不同細胞中的表達水平比較

骨肉瘤細胞SW-1353、HOS、U-2OS、Saos-2 中SNHG3 表達高于成骨細胞hFOB1.19，miR-514a-5p表達低于成骨細胞hFOB1.19，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。見表1。

表1 SNHG3 和miR-514a-5p 在不同細胞中的表達水平比較（，n=9）

表1 SNHG3 和miR-514a-5p 在不同細胞中的表達水平比較（，n=9）

注：與hFOB1.19 組比較，aP <0.05。SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

2.2 敲低SNHG3 后U-2OS 細胞增殖、凋亡及c-Myc、Bax 蛋白表達比較

si-SNHG3 組的SNHG3 表達、細胞活力、c-Myc蛋白表達低于si-NC 組，細胞凋亡率、Bax 蛋白高于si-NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表2。

圖1 敲低SNHG3 后U-2OS 細胞凋亡及c-Myc、Bax 蛋白表達比較

表2 敲低SNHG3 后U-2OS 細胞增殖、凋亡及c-Myc、Bax 蛋白表達比較（，n=9）

表2 敲低SNHG3 后U-2OS 細胞增殖、凋亡及c-Myc、Bax 蛋白表達比較（，n=9）

注：SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

2.3 敲低SNHG3 后U-2OS 細胞遷移和侵襲及MMP-2 蛋白表達比較

si-SNHG3 組遷移細胞、侵襲細胞和MMP-2 蛋白表達低于si-NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。見圖2、表3。

表3 敲低SNHG3 后U-2OS 細胞遷移和侵襲及MMP-2 蛋白表達比較（，n=9）

表3 敲低SNHG3 后U-2OS 細胞遷移和侵襲及MMP-2 蛋白表達比較（，n=9）

注：SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

圖2 敲低SNHG3 后U-2OS 細胞遷移和侵襲及MMP-2 蛋白表達比較

2.4 雙熒光素酶驗證結(jié)果

SNHG3 與miR-514a-5p 存在互補的結(jié)合位點，見圖3。miR-514a-5p 組SNHG3-WT 熒光素酶活性低于miR-NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）；miR-514a-5p 組與miR-NC 組SNHG3-MUT 熒光素酶比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表4。

圖3 SNHG3 和miR-514a-5p 結(jié)合位點

表4 雙熒光素酶驗證結(jié)果（，n=9）

表4 雙熒光素酶驗證結(jié)果（，n=9）

注：SNHG3-WT：SNHG3 野生型；SNHG3-MUT：SNHG3 突變型；SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

2.5 過表達miR-514a-5p 后U-2OS 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表達比較

miR-514a-5p 組miR-514a-5p 表達、細胞凋亡率、Bax 蛋白表達高于miR-NC 組；細胞活力、遷移細胞、侵襲細胞、c-Myc 和MMP-2 蛋白表達低于miRNC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。見圖4、表5。

表5 過表達miR-514a-5p 后U-2OS 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表達比較（，n=9）

表5 過表達miR-514a-5p 后U-2OS 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表達比較（，n=9）

注：SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

圖4 過表達miR-514a-5p 對U-2OS 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

2.6 抑制miR-514a-5p 后敲低SNHG3 對U-2OS 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及c-Myc、Bax 和MMP-2蛋白表達比較

si-SNHG3+anti-miR-514a-5p 組的miR-514a-5p 表達、細胞凋亡率、Bax 蛋白表達低于si-SNHG3+anti-miR-NC 組；細胞活力、遷移細胞、侵襲細胞、c-Myc 和MMP-2 蛋白表達高于si-SNHG3+antimiR-NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。見圖5、表6。

表6 抑制miR-514a-5p 后敲低SNHG3 對U-2OS 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表達比較（，n=9）

表6 抑制miR-514a-5p 后敲低SNHG3 對U-2OS 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表達比較（，n=9）

注：SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

圖5 抑制miR-514a-5p 后敲低SNHG3 對U-2OS 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)治療水平的進步，新的輔助治療骨肉瘤方法已經(jīng)取得了明顯的作用效果，但是仍會出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等不良后果[11-12]。LncRNA 是一種非編碼RNA分子自身沒有編碼蛋白質(zhì)的功能，但是可以通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達[13-14]。Ju 等[15]研究結(jié)果顯示，SNHG5 在骨肉瘤細胞中表達上調(diào)，抑制SNHG5 表達，可以明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。Xu 等[16]研究結(jié)果顯示，SNHG4 在骨肉瘤組織和細胞中表達上調(diào)，其高表達與腫瘤大小和預(yù)后不良有關(guān)，SNHG4 可以海綿化miR-224-3p 調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Chen 等[17]研究結(jié)果顯示，SNHG3 在骨肉瘤組織中表達上調(diào)，與患者預(yù)后和腫瘤大小有關(guān)，抑制SNHG3表達，可以明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖，與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，在骨肉瘤細胞中SNHG3 表達上調(diào)，敲低SNHG3 可以抑制U-2OS 細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡，提示SNHG3 可以作為骨肉瘤潛在生物標(biāo)志物。

miRNA 是一種具有高度保守的非編碼RNA 分子，可以通過調(diào)控靶向mRNA 表達參與腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程[18-19]。miRNA 在骨肉瘤細胞中起著抑癌或促癌的作用，其中miR-1284、miRNA-206、miR-493-5p、miR-501-3p 和miR-502-5p 等已證實[20-21]。miRNA-708 在骨肉瘤細胞中表達下調(diào)，miRNA-708 通過CUL4B 調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的增殖和凋亡[22]。Wang 等[23]研究結(jié)果顯示，miR-423-5p 在骨肉瘤組織和細胞中表達下調(diào)，miR-423-5p 通過靶向STMN1 抑制骨肉瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移。Wu 等[24]研究結(jié)果顯示，miR-17 在骨肉瘤細胞中表達上調(diào)，miR-17可以上調(diào)SASH1 的表達，對于骨肉瘤細胞增長、遷移有一定抑制作用，同時還可以促進細胞凋亡，與本研究結(jié)果相反。miR-514a-5p 在肝癌、鼻咽癌等癌癥中表達下調(diào)[25]，在腫瘤細胞中起著抑癌的作用。本研究結(jié)果顯示，在骨肉瘤細胞中miR-514a-5p 表達下調(diào)，過表達miR-514a-5p 可以抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡。進一步實驗結(jié)果顯示，SNHG3 可以靶向miR-514a-5p 的表達，而抑制miR-514a-5p 逆轉(zhuǎn)了敲低SNHG3 對U-2OS 細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用，提示敲低SNHG3 可以通過調(diào)控miR-514a-5p 發(fā)揮在骨肉瘤細胞中的作用。

綜上所述，SNHG3 在骨肉瘤細胞中表達上調(diào)，敲低SNHG3，或有效調(diào)控miR-514a-5p 表達，可以明顯抑制骨肉瘤細胞增長、遷移、侵襲作用，同時促進細胞凋亡，為骨肉瘤臨床治療提供新的作用靶點。