卜凡淑，牛 陽，張 婷，黃楷迪，錢大瑋，段金廒

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇 南京210023； 2.寧夏醫(yī)科大學回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川750004； 3.中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023）

隨著生活壓力的加大、老年人口的增多，記憶力減退已成為影響人們生活質量的重要因素。八珍益智方來源于《成方便讀》，具有增強智力、延緩衰老、提高記憶力的功效［1］，由龍眼肉、益智仁、陳皮、炙甘草、茯苓、白術、蓮子肉、山藥組成。近年來，八珍益智方在制備工藝、藥理活性方面的研究取得了一定進展［2?3］，但尚無其整方給藥在大鼠體內的代謝產物分析及過程考察。

藥物進入體內后，通常會產生一種或多種代謝產物，對其研究有助于闡明體內藥效物質基礎［4］。高效液相色譜?串聯(lián)質譜（LC?MS／MS）法因其高靈敏度、高選擇性，被廣泛應用于中藥代謝產物的考察中，通過結合基于質量虧損濾過為基礎的代謝物尋找軟件來尋找目標代謝物，再進一步對目標代謝物進行MS／MS 分析，可快速推測復雜生物基質中的代謝產物［5］。本實驗采用超高效液相色譜?線性離子阱?靜電軌道阱串聯(lián)質譜聯(lián)用（UHPLC?LTQ?Orbitrap?MS）法，分析大鼠灌胃給予八珍益智方后血漿、膽汁、尿液、糞便中的非揮發(fā)性成分及代謝產物，以期為該方藥效物質基礎研究提供依據。

1 材料

UltiMate 3000 型超高效液相色譜儀、LTQ?Orbitrap Velos Pro 質譜儀、Xcalibur 3.0 質譜工作站軟件、Metworks 1.3 及Mass Frontier 7.0 分析軟件（美國Thermo 公司）；Anke GL?16G II 型離心機（上海安亭科學儀器廠）；WH?微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；ML204、MS105電子天平［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］。

異甘草苷（R07D8F50056）、異甘草素（C03A8Q41092）、桔皮素（H09M7K14409）、橙皮素（C03F6Y1）、茯苓新酸A（150417）、白楊素（X24O6C4947）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。龍眼肉、茯苓、益智仁、陳皮、炙甘草、山藥、白術、蓮子肉由安徽省亳州市紫銳藥業(yè)有限公司提供，經南京中醫(yī)藥大學嚴輝副教授鑒定為正品，符合2020 年版《中國藥典》 要求，具體見表1。甲酸、甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck 公司）；超純水由Milli?Q 純水機制備。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

清潔級雄性SD 大鼠，約8 周齡，體質量（220±10）g，由北京市維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產合格證號SCXK（京）2016?0006。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度（45±10）%。

2 方法

2.1 檢測條件 ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（A）?水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫（0～7 min，0～5%A；7～12 min，5%～15% A；12～16 min，15%～35% A；16～22 min，35%～45% A；22～25 min，45%～70% A；25～27 min，70%～90% A；27～28 min，90%～100%A；28～30 min，100%A）；體積流量0.4 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。電噴霧離子源（ESI），正負離子掃描模式，掃描范圍m／z50～1 000；采集時間0.8～30 min；毛細管溫度350 ℃；蒸發(fā)器溫度350 ℃；鞘氣流40 kPa；輔助氣流15 kPa；噴霧電壓3.5 V；源電流100 μA；MS2質譜的觸發(fā)方式為動態(tài)數(shù)據依賴分析模式。

2.2 供試品溶液制備 各單味藥材飲片分別按八珍益智方日用處方量稱取，混合均勻后加水回流提取2 次，第1 次按料液比1 ∶12 用水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集揮發(fā)油，過濾提取液，第2 次按料液比1 ∶10 同法提取2 h，過濾提取液，合并濾液，減壓濃縮后制成生藥量為1.40 g／mL，即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取異甘草苷、異甘草素、桔皮素、橙皮素、白楊素、茯苓新酸A 對照品適量，甲醇制成1 mg／mL 溶液，即得。

2.4 分組與給藥 24 只大鼠隨機分為空白組和給藥組，每組12 只（血漿組、膽汁組、尿液／糞便組各4 只），給藥組大鼠灌胃給予八珍益智方水煎液，劑量為13.95 g／kg，加入揮發(fā)油混合均勻，連續(xù)3 d，每天1 次；空白組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。

2.5 生物樣品采集 大鼠最后1 次給藥前禁食不禁水12 h，其中血漿組大鼠于給藥后0.5、1、2、4、6、8 h 眼眶靜脈叢取血各0.5 mL，置于預先涂有1%肝素鈉生理鹽水的EP 管中，4 000 r／min 離心10 min，取上清，即得血漿樣品；膽汁組大鼠用10%水合氯醛麻醉，插入膽管并固定，給藥后收集10 h 內膽汁；尿液／糞便組大鼠收集36 h 內尿液／糞便，每12 h 1 次。樣品均置于－80 ℃下保存。

2.6 生物樣品處理

2.6.1 血漿 將大鼠各時間點血漿樣品等體積合并，以消除個體差異性。取300 μL 血漿樣品，加入3 倍量甲醇沉淀蛋白，渦旋30 s，12 000 r／min離心10 min，取上清液離心濃縮，加入0.1%甲酸、甲醇各50 μL 復溶，12 000 r／min 離心10 min，取上清液。

2.6.2 膽汁 取大鼠各時間點混合膽汁樣品200 μL，加入200 μL 甲醇渦旋30 s，12 000 r／min離心10 min，取上清液。

2.6.3 尿液 取大鼠各時間點混合尿液樣品500 μL，加入500 μL 甲醇渦旋30 s，12 000 r／min離心10 min，取上清液，離心濃縮，加入200 μL 0.1%甲酸復溶，12 000 r／min 離心10 min，取上清液。

2.6.4 糞便 將大鼠不同時間點糞便按質量比混合，取0.5 g，加1.5 mL 50%甲醇超聲處理30 min，上清液渦旋30 s，12 000 r／min 離心10 min，取上清液。

3 結果

3.1 UHPLC?LTQ?Orbitrap?MS 分析通過MetWorks代謝物鑒定軟件中的質量虧損過濾功能，除去基質中的信號干擾，結合對照品及參考文獻中的保留時間，一級、二級質譜信息，共得到46 種成分，其中原型6 種，代謝產物40 種。提取離子流圖見圖1～2。

圖1 正離子模式下提取離子流圖Fig.1 Extracted ion current chromatograms in positive ion mode

以八珍益智方水提液前期分析為基礎，確定其主要成分為黃酮、三萜酸、三萜皂苷。藥物的氧化代謝產物及部分結合代謝產物質量虧損值近似于母藥，但某些代謝反應的質量虧損會具有明顯變化，如母藥分子產生裂解反應、谷胱甘肽結合反應、脫烷基代謝產物等。本實驗依據這一規(guī)律，根據取代基的種類和數(shù)量設定參數(shù)，見表2。

圖2 負離子模式下提取離子流圖Fig.2 Extracted ion current chromatograms in negative ion mode

表2 質量虧損參數(shù)Tab.2 Parameters for mass defects

將質量虧損設置為較寬范圍進行初步篩選，雖然基質干擾離子在一定程度上會相應增加，但也可發(fā)現(xiàn)更多目標及非目標化合物，再結合ppm 小于1.0×10－5的條件尋找符合代謝修飾的代謝產物準分子離子峰，依據文獻報道、二級質譜碎片離子分析代謝物結構特征，通過Mass Frontier 7.0 譜圖解析軟件作進一步驗證，即可得到各類化合物相應代謝物。以糞便樣品正離子檢測模式為例，其總離子流圖和經質量虧損過濾后的總離子流圖見圖3，可知經質量虧損過濾后的TIC 基線更平穩(wěn)，色譜峰也有所增強。

圖3 糞便樣品在正離子模式下（A）、經質量虧損過濾后總離子流圖（B）Fig.3 Total ion current chromatograms of stool sample in positive ion mode（A）and after mass defect filtering（B）

3.2 代謝產物分析

3.2.1 異甘草苷（A）、異甘草素（B）共鑒定出4 個異甘草苷代謝產物、10 個異甘草素代謝產物，具體見表3、圖4。其中，異甘草苷的主要碎片離子m／z255，為異甘草苷脫去一分子葡萄糖產生的碎片離子，也是異甘草素的特征分子離子峰；異甘草素屬查爾酮類衍生物，2 個苯環(huán)之間有3 個碳原子相連，其中2 個碳原子由α、β?不飽和碳構成，易發(fā)生RDA 裂解產生m／z135、119、91 的特征碎片離子。A0 是異甘草苷，保留時間為16.80 min，負離子模式下準分子離子峰為m／z417.115 5 ［M?H］－，具有m／z255 的特征碎片離子，進一步脫一分子C8H8O 產生m／z135.066 3 的碎片，與對照品相符；代謝物A1、A2、A3 的準分子離子峰分別為m／z433.110 9、449.105 8、497.072 4，比異甘草苷大16、32、80，而且都具有255 的特征碎片離子，推測為異甘草苷單氧化、雙氧化和硫酸化產物；A4 比A1 大80，推測為異甘草苷氧化硫酸化產物。

圖4 異甘草苷（A）、異甘草素（B）代謝途徑Fig.4 Metabolic pathways of isoliquiritin（A）and isoliquiritigenin（B）

表3 異甘草苷、異甘草素代謝產物Tab.3 Metabolites of isoliquiritin and isoliquiritigenin

在體內代謝過程中，異甘草苷結構中的糖苷鍵易于水解丟失葡萄糖而形成苷元，代謝物B0 分子量較異甘草苷少162，保留時間為20.04 min，準分子離子峰為m／z255.066 9 ［M?H］－，在MS／MS圖譜上觀察到m／z135、119、91 的碎片離子，與對照品相符，鑒定為異甘草素；代謝物B1、B2 分子量分別比異甘草素大57、119，推測其為異甘草素甘氨酸和半胱氨酸結合產物；B3、B6、B8 分子量分別比 異甘草素大16、32、48，具 有m／z135.066 3 的特征碎片，推測為異甘草素單氧化、雙氧化、三氧化產物；B4、B7 分子量分別比B3、B6 大80，可能為后者硫酸化產物；B5 分子量比B3 大176，具有m／z255、135 的特征碎片，推測為異甘草素的氧化醛酸化產物；B9、B10 分子量比異甘草素大176、256，可能為醛酸化、醛酸化加硫酸化產物；B11 分子量比異甘草素大2，具有m／z135、91 的特征碎片，推測為異甘草素的還原產物。Ⅱ相反應（如葡萄糖醛酸化、硫酸化）為異甘草素主要代謝途徑，與文獻［6?8］ 報道一致。

3.2.2 白楊素（C）共鑒定出4 個白楊素代謝產物，具體見表4、圖5。其中，C0 保留時間為22.34 min，正離子模式下準分子離子峰為m／z255.063 5 ［M＋H］＋，具有m／z153.018 2 的特征碎片離子，與對照品相符，鑒定為白楊素；C1 準分子離子峰為m／z335.004 7 ［M＋H］＋，比白楊素大80，而且有m／z255 的碎片離子，推測為白楊素的硫酸化產物；C2 分子量比白楊素大176，推測為白楊素的葡萄糖醛酸化產物［9］；C3 分子量比白楊素大16，具有m／z255、153 的碎片，可能為白楊素的羥基化產物；C4 分子量比白楊素大14，可能為甲基化產物，雖然白楊素的7′?OH 甲基化為楊芽黃素，但C4 與其對照品保留時間不一致，故甲基化反應發(fā)生在5′?OH。

3.2.3 茯苓新酸A（D）共鑒定出4 個茯苓新酸A 代謝產物，具體見表4、圖5。其中，D0 是茯苓新酸A，保留時間為27.15 min，正離子模式下準分子離子峰為m／z499.341 4 ［M ＋H］＋，m／z463.320 7為脫兩分子H2O 產生的碎片，與對照品相符；D1 為D0 的脫甲基產物，m／z411.315 6 為其脫一分子C3H6O2產生的碎片；D2 分子量比D1大80，可能D1 的硫酸化產物；D3 分子量比D0 小2，m／z479.315 6 為脫水產生的碎片，推測為茯苓新酸A 的脫氫產物；D4 分子量比D1 大2，m／z413.315 6為脫C3H6O2的碎片，推測為茯苓新酸A 脫甲基后的還原產物。上述代謝途徑與文獻［10］ 報道一致。

3.2.4 橙皮素（E）共鑒定出5 個橙皮素代謝產物，具體見表4、圖5。其中，E0 是橙皮素，保留時間為19.15 min，正離子模式下準分子離子峰為m／z303.087 7 ［M＋H］＋，m／z285.075 7 為脫一分子H2O 碎片，m／z177.054 6 為橙皮素脫一分子C6H6O3產生的特征離子碎片，與對照品相符；E1、E2 分子量分別比橙皮素大80、176，均含有m／z303、153 的碎片，推測分別為橙皮素的硫酸化、醛酸化結合產物；E3 分子量比橙皮素大14，推測為橙皮素的甲基化產物；E4 分子量比橙皮素小14，具有m／z135 的離子碎片，可能為橙皮素的脫甲基產物；E5 比橙皮素小30，具有m／z153 的碎片，可能為橙皮素的脫甲氧基產物［11?12］。

圖5 白楊素（C）、茯苓新酸A（D）、橙皮素（E）代謝途徑Fig.5 Metabolic pathways of chrysin（C），poricoic acid A（D）and hesperetin（E）

表4 白楊素、茯苓新酸A、橙皮素代謝產物Tab.4 Metabolites of chrysin，poricoic acid A and hesperetin

3.2.5 桔皮素（F）共鑒定出12 個桔皮素代謝產物，具體見表5、圖6。其中，F(xiàn)0 是桔皮素，保留時間為24.06 min，正離子模式下準分子離子峰為m／z373.125 5 ［M＋H］＋，m／z358.104 7 為脫一分子CH3碎片，m／z343.117 6 為進一步脫CH3碎片，與對照品相符；F1?1、F1?2、F1?3 分子量比桔皮素小14，保留時間不一致，但都具有m／z344 脫甲基碎片，推測為桔皮素不同位點的脫甲基反應；F2、F3、F4 分子量分別比F1 大16、80、176，可能為桔皮素脫甲基使酚羥基暴露從而進一步發(fā)生羥基化、硫酸化、醛酸化結合反應；F5、F6 分子量分別比F2 大80、176，可能為桔皮素脫甲基后發(fā)生羥基硫酸化和羥基醛酸化的多步代謝反應；F7分子量比桔皮素小28，均具有脫一分子CH3的m／z330.073 4 碎片離子，推測為桔皮素不同位點的雙脫甲基反應；F8 分子量比F7 大16，可能為桔皮素雙脫甲基后的羥基化代謝物；F9 分子量比桔皮素小36，可能為桔皮素的三脫甲基產物。上述代謝途徑與文獻［13］ 報道一致。

圖6 桔皮素（F）代謝途徑Fig.6 Metabolic pathway of tangeretin（F）

表5 桔皮素代謝產物Tab.5 Metabolites of tangeretin

4 討論與結論

異甘草苷在大鼠體內主要生成脫葡萄糖基的苷元異甘草素，進而發(fā)生一系列II 相結合反應。代謝物在膽汁中較少，大多見于尿液、糞便中，說明膽汁排泄不是異甘草素在大鼠體內的主要排泄途徑［14］；在尿液、糞便中可檢測到白楊素原型存在，但共同成分——楊芽黃素可去甲基形成白楊素，故并不能排除部分白楊素是由該成分脫甲基轉化而來。本實驗中水提液提取時間為6 h，在長時間高溫煎煮下，小極性化合物被少量提取出來，在糞便中檢測出3 種代謝產物［10］。前期發(fā)現(xiàn)，八珍益智方水提取物中橙皮苷含量很高，但大鼠體內并未發(fā)現(xiàn)其原型物；文獻［15］ 報道，橙皮苷在體內可轉化為橙皮素后被吸收，但本實驗僅在血漿、尿液中檢測到橙皮素原型和代謝物。桔皮素雖無游離的酚羥基結構，但在體內容易通過Ⅰ相代謝酶的催化，將甲氧基轉化為羥基進而發(fā)生Ⅱ相代謝反應。多甲氧基黃酮類化合物的代謝物比原型具有更好的抗炎活性［16］，故桔皮素在體內的主要代謝通路為去甲基，其主要代謝物大多分布在膽汁、尿液中。

八珍益智方中龍眼肉、山藥主要成分為多糖、蛋白質、氨基酸，蓮子肉主要成分為蛋白質、淀粉，白術主要成分為多糖、揮發(fā)油、內酯，但無法確定蛋白質、多糖代謝產物；內酯在藥材中含量較低，或吸收進入體內后經代謝、分布、排泄等而在血、尿中含量很低，導致超出儀器檢測限而無法測得，具體仍需進一步研究。

綜上所述，本實驗 首次利 用UHPLC?LTQ?Orbitrap?MS 法對大鼠灌胃給予八珍益智方后非揮發(fā)性成分的體內代謝產物進行研究，可為進一步探討該方體內過程、闡明其功效物質基礎提供依據。