游蓉麗，林 珊，楊曉寧，高治華，姚 靜

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100700； 2.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海200433；3.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京100085； 4.山西振東泰盛制藥股份有限公司，山西 大同 037010）

舒血寧注射液是由銀杏葉提取物制成的中藥注射劑，臨床上主要用于治療缺血性心腦血管疾病、冠心病、心絞痛等，具有較好的療效［1?3］，其主要活性成分為銀杏內(nèi)酯、黃酮［4?6］，前期大多采用HPLC?ELSD 法測定銀杏內(nèi)酯A、B、C 和白果內(nèi)酯含量［7］，但流動(dòng)相采用非常規(guī)、復(fù)雜的正丙醇?甲醇?四氫呋喃?水系統(tǒng)，而且樣品前處理時(shí)需進(jìn)行乙酸乙酯萃取、復(fù)溶等操作［8］，增加了準(zhǔn)確定量難度和分析工作量。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的甲醇?水流動(dòng)相系統(tǒng)，并在簡化樣品前處理方法的基礎(chǔ)上，以更易得、廉價(jià)的銀杏內(nèi)酯A 為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算它與銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯的相對校正因子，建立一測多評法同時(shí)測定舒血寧注射劑中上述4 種成分的含量［9?10］，以期為該制劑質(zhì)量評價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜系統(tǒng)（配置四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD 檢測器）、Agilent 385?ELSD 蒸發(fā)光散射檢測器（美國Agilent Technologies公司）；MSA365?OCE?OH 電子分析天平（德國Sartorios 公司）；Milli?Q Advantange A10 純水機(jī)（美 國Millipore 公司）；KQ?250DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 銀杏內(nèi)酯A（純度97.4%，批號110862?201602）、銀杏內(nèi)酯B（純度95.6%，批號110863?201611）、白果內(nèi)酯（純度99.8%，批號110865?201507）、銀杏內(nèi)酯C（純度94.0%，批號110864?201809）對照品均購于中國食品藥品檢定 研究院。舒血寧 注射液（批 號 1905262、1905271、1905272、1905281、1905282、1906181、1906182、1906191、1906192）由振東泰盛藥業(yè)有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純［阿達(dá)瑪斯試劑（上海）有限公司］。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C 對照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含四者0.09、0.25、0.13、0.19 mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取舒血寧注射液適量，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件TSK gel ODS?100V 色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相水（A）?甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，90%～75%A，10%～25%B；10～50 min，75%～65% A，25%～35% B；50～55 min，65%～40%A，35%～60%B）；體積流量0.6 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；ELSD檢測器漂移管溫度90 ℃；氮?dú)猓∟2）體積流量1.5 L／min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 文獻(xiàn)［4?5］ 報(bào)道，舒血寧注射液主要成分為銀杏內(nèi)酯、黃酮醇苷。圖1 顯示，樣品中該成分色譜峰分離較好，相同條件下空白溶劑無干擾峰，表明該方法專屬性良好。

圖1 各銀杏內(nèi)酯HPLC?ELSD 色譜圖Fig.1 HPLC?ELSD chromatograms of various ginkgolides

2.3.2 線性關(guān)系考察 制備6 個(gè)質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以各成分進(jìn)樣量的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，并分別以信噪比（S／N）10 ∶1、3 ∶1 為定量限、檢測限，結(jié)果見表1，可知各銀杏內(nèi)酯在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各銀杏內(nèi)酯線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various ginkgolides

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液20 μL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，計(jì)算日內(nèi)精密度；另精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測定3 d，每天2 次，計(jì)算日間精密度，測得白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C 峰面積RSD 分別為2.82%、2.16%、2.04%、3.26%，表明該方法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取注射液（批號1905262）6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL 測定，測得白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C 含量RSD 分別為1.99%，2.15%，1.85%，2.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取注射液（批號1905262）1份，于0、3、6、9、12、24 h 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL 測定，測得白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C 峰面積RSD 分別為3.09%、3.19%、2.30%、3.82%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取5.0 mL 注射液（批號1905262）至10 mL 量瓶中，平行9 份，其中3 份加入對照品溶液0.5 mL，甲醇定容，作為低質(zhì)量濃度組供試品溶液；3 份加入對照品溶液1.0 mL，甲醇定容，作為中質(zhì)量濃度組供試品溶液；3 份加入對照品溶液1.5 mL，甲醇定容，作為高質(zhì)量濃度組供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣20 μL 測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.4 相對校正因子測定 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液4、8、10、15、20、25 μL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以銀杏內(nèi)酯A 為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他3 種成分的相對校正因子fs／k，公式為fs／k＝（Ms×lgAk）／（Mk×lgAs），其中Ms為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量，Mk為其他成分質(zhì)量，lgAs為內(nèi)標(biāo)峰面積對數(shù)，lgAk為其他成分峰面積對數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 各成分相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.5 色譜峰定位 分別在不同柱溫、體積流量、色譜儀下測定相對保留時(shí)間，結(jié)果見表4～6，可知RSD 或相對誤差均＜2%，表明以相對保留時(shí)間定位色譜峰合理可行。

表4 不同柱溫下相對保留時(shí)間Tab.4 Relative retention time under different column temperatures

表5 不同體積流量下相對保留時(shí)間Tab.5 Relative retention time under different volumetric flow rates

表6 不同色譜儀下相對保留時(shí)間Tab.6 Relative retention time under different chromatographic instruments

2.6 耐用性考察 取同一份注射液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，并分別在不同柱溫、體積流量、色譜儀下對相對校正因子進(jìn)行考察，結(jié)果見表7～9，可知RSD或相對誤差均＜2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

表7 不同柱溫下相對校正因子Tab.7 Relative correction factors under different column temperatures

表8 不同體積流量下相對校正因子Tab.8 Relative correction factor under different volumetric flow rates

表9 不同色譜儀下相對校正因子Tab.9 Relative correction factors under different chromatographic instruments

2.7 樣品含量測定 取9 批舒血寧注射液，分別采用外標(biāo)法、一測多評法測定4 種銀杏內(nèi)酯含量，再通過SPSS 14.0 軟件對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果見表10，可知均無顯著差異［相對平均偏差（RAD）＜2%］，表明一測多評法穩(wěn)定可行。

表10 各銀杏內(nèi)酯含量測定結(jié)果（n＝9）Tab.10 Results of content determination of various ginkgolides（n＝9）

3 討論

3.1 流動(dòng)相確定 2020 年版《中國藥典》 一部含量測定項(xiàng)［11］及文獻(xiàn)［12?13］ 報(bào)道中檢測銀杏內(nèi)酯時(shí)，均采用四氫呋喃，但其毒性較大。本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇?水、甲醇?乙腈?水體系下目標(biāo)化合物的分離效果，發(fā)現(xiàn)前者洗脫時(shí)4 種成分色譜峰的峰形、分離度良好，基線平穩(wěn)，而且更簡便環(huán)保。

3.2 樣品處理方法確定 為了更準(zhǔn)確地反映舒血寧注射液中萜類、內(nèi)酯類成分的真實(shí)含量，本實(shí)驗(yàn)采用注射液直接進(jìn)樣的方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)4 種成分的分離效果良好，雜質(zhì)無干擾。相對于文獻(xiàn)［8，12?14］ 采用乙酸乙酯萃取、蒸干、復(fù)溶等前處理方法，本實(shí)驗(yàn)可大大減輕分析人員的工作量，并提高含量測定的準(zhǔn)確性。

3.3 一測多評法考察 銀杏內(nèi)酯A 是舒血寧注射液主要特征成分之一，含量較高，而且其對照品容易獲得，質(zhì)量穩(wěn)定，價(jià)格低廉，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為內(nèi)標(biāo)［14］。再考察了在不同色譜儀、柱溫、體積流量下白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C 的相對保留時(shí)間及相對校正因子，發(fā)現(xiàn)其重復(fù)性均較好。最后，將一測多評法所得結(jié)果與外標(biāo)法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)無明顯差異，表明該方法可用于舒血寧注射液中4 種銀杏內(nèi)酯含量的測定。