盧發(fā)光，顧立峰，劉昱茜，任 楨，施 雨，徐振然，周桂生，盧海潼，王小山，張網(wǎng)定，任志強(qiáng)，朱廣龍

（1.揚(yáng)州大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；4.揚(yáng)州市氣象局，江蘇揚(yáng)州 225009；5.山西省呂梁市臨縣畜牧技術(shù)推廣站，山西呂梁 033200）

土地鹽堿化嚴(yán)重威脅作物正常生長，限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)共同面臨的困難[1-2]。中國是鹽堿地大國，鹽堿荒地和影響耕種的鹽堿地總面積超過3.33×107hm2，其中具有農(nóng)業(yè)發(fā)展?jié)摿Φ恼贾袊乜偯娣e的10%以上[3]。鹽土種植業(yè)是農(nóng)業(yè)綜合生態(tài)開發(fā)的主要部分，具有不可替代性[4-5]。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是當(dāng)今世界栽培最廣泛的牧草之一，因具有干草產(chǎn)量高、草地持久性強(qiáng)、耐旱、耐寒性強(qiáng)、易成活等特點(diǎn)，適合在鹽堿地種植，在修復(fù)土壤環(huán)境中也有重要潛力，并且多年種植對鹽堿地改良具有明顯效果[6-7]。施肥是提高紫花苜?？剐?、確保其資源可持續(xù)利用的有效方法，但過量施用則會影響其對其他營養(yǎng)的吸收，并且造成肥料浪費(fèi)和環(huán)境污染[8]。因此，合理施肥是調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分平衡、維持和提高土壤肥力的重要措施之一。本研究以紫花苜蓿WL919為材料，在江蘇沿海灘涂鹽堿地設(shè)置密度和施氮量兩個試驗(yàn)因子，研究不同種植密度以及施氮量對鹽堿地紫花苜蓿產(chǎn)量、生理特性等的影響，以期為沿海鹽堿地苜蓿高產(chǎn)栽培提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2019?2020年在江蘇省鹽城市大豐區(qū)大豐沿海林場(33°20′N，120°47′E)鹽堿地進(jìn)行。該地區(qū)屬亞熱帶與暖濕帶的過渡地帶，四季分明，氣溫適中，常年平均氣溫14.1℃，雨量充沛，常年降水總量1042.2 mm，適宜喜濕作物的生長，無霜期213 d，年日照2 238.9 h。試驗(yàn)地土壤pH 8.4，有機(jī)質(zhì)含量19.75 g·kg?1，全氮含量0.72 g·kg?1，速效磷含量1.45 mg·g?1，速效鉀含量279 mg·g?1，鹽分(主要包括氯化鹽、碳酸鹽)平均含量為1.68 g·kg?1。

1.2 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為紫花苜蓿WL919，設(shè)置3個播種量15.0(D1)、30.0(D2)和45.0 kg·hm?2(D3)，3個施氮量150.0(N1)、225.0(N2)和300.0 kg·hm?2(N3)，播種方式為撒播，覆土深2～4 cm。采用種植密度和施氮量2個因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，小區(qū)面積為30 m2。氮肥按5?5分別作基肥和返青肥施入。此外，每個處理施磷肥225 kg·hm–2，在播種前作基肥施入，2019年11月5日播種。

1.3 取樣與測定

在紫花苜蓿全年生育期共取樣4次，分別于播種后60 d(苗期)、90 d(分枝期)、120 d(現(xiàn)蕾期與初花期)、150 d(成熟期)，每個小區(qū)取0.5 m2內(nèi)的全部植株，稱取鮮重，測量株高，烘干稱量干重，每個小區(qū)另取5株苜蓿頂部葉片，用于測定生理指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測定及方法

株高：每個小區(qū)測量10株紫花苜蓿植株的自然高度，求平均值。

鮮重：每個小區(qū)取樣0.5 m2苜蓿后立即稱量鮮重，然后換算成每公頃的產(chǎn)量。

干重：將取回的鮮樣置于105℃烘箱內(nèi)，殺青30 min 后再置于75℃烘箱內(nèi)烘至恒重，稱重。

生理指標(biāo)：另取10 株植株上部同一部位的葉片，葉綠素含量采用乙醇– 丙酮混合提取法[9]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法[10]，脯氨酸含量采用茚三酮法[11]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用四氮唑藍(lán)(NBT)還原法[12]，過氧化氫酶(CAT)活性用紫外線吸收法[13]，過氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚法[14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，用Statistix 9對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種植密度和施肥對苜蓿生長和產(chǎn)量的影響

2.1.1 對株高的影響

在各生長時期施氮量顯著影響苜蓿的株高(P<0.05) (表1)，而種植密度、密度與氮肥的互作效應(yīng)僅在播種后120和150 d 對株高有顯著影響(P< 0.05)。種植密度相同時，低密度(D1)下，播種后60、90和120 d的株高隨著施氮量的增加而增加；中等密度(D2)下，整個生育期的株高隨著施氮量的增加先增后減；高密度(D3)下，播種后120和150 d 時，株高隨著施氮量的增加呈現(xiàn)先增后減趨勢。施氮量相同時，低氮(N1)下，播種后90 d 時株高隨著種植密度的增加而增加；中氮(N2)下，播種后90、120和150 d的株高隨著種植密度的增加呈先增后減趨勢；高氮(N3)下，播種后90、120和150 d 的株高隨著種植密度的增加而減少。種植密度和施氮量互作條件下，播種后150 d 時D2N1和D2N2處理下的株高較高，與D1N1處理相比株高分別增加了18.23%和27.15%。在整個生育時期，D2N2互作條件下的株高均高于其他的密度和施肥互作處理(表1)。

表1 不同種植密度和施氮量下紫花苜蓿不同時期的株高Table 1 Alfalfa plant heights at the different planting densities and nitrogen rates cm

2.1.2 對苜蓿干草產(chǎn)量的影響

種植密度和施氮量對各時期干草產(chǎn)量的影響均達(dá)極顯著水平(P< 0.01) (表2)，兩者互作在播種后120和150 d 對干草產(chǎn)量影響顯著(P<0.05)。密度不變的條件下，整個生育期的干草產(chǎn)量在低密度條件下隨著施氮量的增加而增加；中等密度下，所有時期的干草產(chǎn)量都隨著施氮量的增加先增后減；高密度下，除播種60 d 外，其余時期的干草產(chǎn)量都隨著施氮量的增加而增加。施氮量相同時，低氮下，播種后90和150 d 時，干草產(chǎn)量隨著種植密度的增加而增加；中氮下，整個時期的干草產(chǎn)量隨著種植密度的增加呈先增后減趨勢；高氮條件下，播種后90、120和150 d 時，干草產(chǎn)量則隨著種植密度的增加而增加。種植密度和施氮量互作條件下，播種后150 d時，D2N2、D3N3處理下干草產(chǎn)量較大，與D1N1處理相比干草產(chǎn)量分別增加了133.2%和84.9%。

表2 不同種植密度和施氮量下紫花苜蓿不同時期的干草產(chǎn)量Table 2 Alfalfa dry biomass yield at the different planting densities and nitrogen rates kg·hm–2

苜蓿的干草產(chǎn)量隨著生育期的生長而增加，在播種后150 d 達(dá)到最大值。但此時紫花苜蓿葉片開始減小，含水量降低，營養(yǎng)品質(zhì)以及各項(xiàng)生理特性均有所下降，對紫花苜蓿的飼草品質(zhì)有很大的影響。因此，若將紫花苜蓿作為干草飼料收獲，最適宜的時期是在播種后的120 d 左右，此時紫花苜蓿正處于現(xiàn)蕾期和初花期，也是最適合收獲的時期。

2.2 種植密度和施肥對苜蓿生理生化特性的影響

2.2.1 對丙二醛含量的影響

播種后60 d 時，苜蓿MDA 含量相對較低，播種后90 d 時，含量最高(圖1)。種植密度相同時，低密度下，播種后60和90 d 時，MDA 的含量受施氮量影響較?。徊シN120 d、中高密度下，MDA 含量隨著施氮量的增加呈先減后增的趨勢。當(dāng)施氮量相同時，低氮條件下，播種后60和90 d 時，MDA 含量隨著密度的增加而減少；高氮條件下，播種120 d 時，MDA 含量隨著種植密度的增加而增加。兩者互作條件下，播種90 d MDA 含量最高，在D1N3處理下達(dá)到最大，播種后120 d 時，在D3N1處理下MDA 含量達(dá)到最大，最小值出現(xiàn)在D3N2組合。

圖1 不同種植密度和施氮量下丙二醛的含量Figure 1 Malondialdehyde (MDA)content at the different planting densitiesand nitrogen rates

2.2.2 對脯氨酸含量的影響

隨著生育期的推進(jìn)，紫花苜蓿葉片中脯氨酸含量逐漸增加，在播種后120 d 時的D2N2組合下達(dá)到最大，為932.3μg·g?1(圖2)。種植密度相同時，低密度下，播種后90和120 d 時，苜蓿葉片脯氨酸含量隨施氮量增加先減后增；中等密度時，整個時期脯氨酸的含量隨施氮量增加而先增后減，最大值均出現(xiàn)在D2N2組合；高密度下，播種后90和120 d 時，苜蓿葉片脯氨酸含量也隨著施氮量增加呈現(xiàn)先減后增的趨勢。施氮量相同條件下，低氮(N1)播種后120 d 時脯氨酸含量隨著密度增加而增加；中氮(N2)條件下，整個生育期脯氨酸含量隨著密度增加先增大后減?。桓叩?N3)條件下，在播種后60和90 d時，葉片內(nèi)脯氨酸含量也隨著密度增加而先增后減。在種植密度和施氮量互作條件下，播種后60 d，葉片內(nèi)脯氨酸含量差異不顯著(P>0.05)，播種后90和120 d，D2N2處理的脯氨酸含量明顯高于其他處理。在播種后120 d 時，D2N2和D3N3處理下脯氨酸含量較高，與D1N1處理相比脯氨酸含量分別增加了24.3%和21.6%。

圖2 不同種植密度和施氮量下脯氨酸的含量Figure2 Prolinecontent at thedifferent planting densitiesand nitrogen rates

2.2.3 對超氧化物歧化酶活性的影響

隨著生長時間的推移，紫花苜蓿葉片內(nèi)SOD活性逐漸降低，播后60 d 時D2N2組合下達(dá)到最高值1650.5 U·g?1(圖3)。種植密度相同時，低密度下施氮量對SOD活性的影響不明顯；中密度下，SOD活性隨施氮量增加呈先增后減；高密度下，播種后90和120 d時，SOD活性隨著施氮量的增加先減少后增加。施氮量相同時，SOD活性隨著密度增加而先增后減。

圖3 不同種植密度和施氮量下超氧化物歧化酶的活性Figure 3 Superoxide dismutase (SOD)activity at the different planting densities and nitrogen rates

2.2.4 對過氧化物酶活性的影響

隨著生長時間的推移，紫花苜蓿葉片內(nèi)POD活性先增加后減少，播后90 d 時D3N3處理下的POD活性達(dá)到最高，為324.7 U·(g·min)–1。低密度和高密度處理下，播后60和90 d 時，POD活性隨著施氮量增加而增加。中密度下，POD活性隨著施氮量增加呈先增后減趨勢。施氮量相同時，中氮處理下，紫花苜蓿葉片POD活性隨著密度增加先增后減。整個生育期在種植密度和施氮量互作條件下，高密度和高施氮量(D3N3)處理下的POD活性均高于其他處理。播后120 d，D1N2和D2N2處理下POD活性最高，與D1N1處理相比分別增加了43.7%和53.9%(圖4)。

圖4 不同種植密度和施氮量下過氧化物酶的活性Figure 4 Peroxidase dismutase (POD)activity at the different planting densities and nitrogen rates

2.2.5 對過氧化氫酶活性的影響

隨著生長時間的推移，苜蓿CAT 活性的變化趨勢是播種后90 d > 播種后60 d > 播種后120 d (圖5)。低密度下，播后90 d 時，CAT 活性隨著施氮量增加而增加；中高密度下，CAT 活性隨著施氮量增加先增后減。施氮量相同時，中氮和高氮下，播種后60和90 d 時，CAT活性隨著密度增加先增后減；播種后120 d 時，密度對CAT 的活性幾乎沒有影響。種植密度和施氮量互作條件下，3個時期CAT 活性均在中密度下最大，播后60 d 時，D2N2處理下CAT 活性較D1N1處理增加了124.7%；播后90 d 時，D2N2處理下CAT活性較D1N1處理增加了62.8%；播后120 d 時，D2N2處理下CAT活性較D1N1處理增加了82.1%。

圖5 不同種植密度和施氮量下過氧化氫酶的活性Figure 5 Catalase (CAT)activity at the different planting densities and nitrogen rates

3 討論與結(jié)論

3.1 種植密度和施氮量對紫花苜蓿生長和產(chǎn)量的影響

種植密度是影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的關(guān)鍵因素[15]。密度過小時，雖然單株所獲得的土壤養(yǎng)分增加，光合面積和時間也增加，但由于單位面積群體小，導(dǎo)致產(chǎn)量較低[16]。密度過大時，單株所吸收的養(yǎng)分減少，受到的光照也減少，同樣不利于產(chǎn)量的提高[17]。本研究結(jié)果表明，紫花苜蓿的株高在中低氮下隨著密度的增加呈先增后減趨勢，在中密度(D2)下最高，說明中密度(D2)最利于試驗(yàn)地紫花苜蓿株高的增加。高氮(N3)水平下，株高則隨著密度的增加而減少，說明施氮量和種植密度互作時，高氮水平下種植密度越高，紫花苜蓿株高越小。干草產(chǎn)量隨著密度的增加先增加后減少，因此，中密度(D2)有利于鹽堿地紫花苜蓿產(chǎn)量的提高，種植密度過高或過低都不利于鹽堿地紫花苜蓿產(chǎn)量的提高，這與孟凱等[18]的研究結(jié)果相同。

氮是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組成成分，蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、酶、維生素、生物堿和一些激素都含有氮元素[19]。植物體內(nèi)的各項(xiàng)生命活動，如光合作用、細(xì)胞增長分裂和遺傳變異等均有氮的參與。因此，氮對植物的生命活動、產(chǎn)量的形成與品質(zhì)的優(yōu)劣有著極為重要的作用。有研究表明，施氮后，紫花苜蓿的株高、單株分枝數(shù)和干重均顯著增加[20]，但是施氮量過高不利于紫花苜蓿粗蛋白含量的增加，也不利于粗纖維含量的降低[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，增加施氮量有利于堿地紫花苜蓿的株高和干草產(chǎn)量的增加。種植密度和氮肥互作條件下，中等度(D2)水平下，施氮量過高又不利于鹽堿地紫花苜蓿的產(chǎn)量的提高。

紫花苜蓿的最佳收獲時期是現(xiàn)蕾期至初花期，綜合種植密度和施氮量互作對株高、干草產(chǎn)量以及飼草品質(zhì)的影響，結(jié)合前人研究，對于江蘇沿海鹽堿地來說，中等密度和中等施氮量互作條件下，播種后120 d左右割刈，此時苜蓿的粗蛋白含量較其他時期高，粗纖維和木質(zhì)素等含量較其他時期含量低，相對飼草價(jià)值較高，同時也是紫花苜蓿的最佳收獲時期，最適合作為飼草收割，此時干草產(chǎn)量最高產(chǎn)量可以達(dá)到11 057.2 kg hm–2[22-23]。

3.2 種植密度和施氮量對紫花苜蓿生理特性的影響

MDA 是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，會導(dǎo)致膜損傷的加劇，MDA 含量可以表征膜脂過氧化的程度和膜系統(tǒng)的受損程度，因此是植物衰老生理和抗逆性生理研究中的常用指標(biāo)[24-25]。本研究結(jié)果表明，高密度種植不利于MDA 含量的降低，降低密度可以降低MDA 含量。播種后90和120 d 時，低氮(N1)條件下MDA 含量最大，說明增施氮肥可以降低MDA 含量。

脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脯氨酸除了作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢等方面起重要作用。植物體內(nèi)的脯氨酸含量越高，則代表植物的抗逆性越強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，脯氨酸含量隨著種植密度的增加先增后減，說明中密度(D2)可以提高植物葉片內(nèi)脯氨酸的含量，高密度(D3)則會導(dǎo)致葉片內(nèi)脯氨酸含量的降低。氮肥對苜蓿葉片內(nèi)脯氨酸含量的影響各有不同，但整體來看，增施氮肥能提高葉片內(nèi)脯氨酸的含量。在種植密度和施氮量互作條件下，播后60 d 葉片內(nèi)脯氨酸含量沒有明顯區(qū)別，播后120和150 d，D2N2處理下，葉片內(nèi)脯氨酸的含量要明顯高于其他處理，說明種植密度和施氮量互作條件下，中密度下施氮有利于提高鹽堿地紫花苜蓿的抗逆性。

活性氧(ROS)的形成是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，并且在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要作用，一般來說，植物體內(nèi)的活性氧可以自我清除，不會危害到植物本身[26]。然而在環(huán)境壓力下(如干旱，鹽度和寒冷等)，ROS水平會急劇增加并對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重危害?？寡趸窼OD、CAT、POD等可以清除過多的ROS，以維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和功能性[27]。不同種植密度下，冬小麥(Triticum aestivum)開花后旗葉SOD和POD活性都隨密度的增加而下降[28]。玉米(Zea mays)生育后期穩(wěn)位葉POD、CAT和SOD的活性隨著施氮量的增加逐漸增加，MDA含量則隨著施氮量的增加而減少[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，種植密度對CAT活性的影響不明顯，SOD活性隨著種植密度的增加先增后減。POD活性隨著密度增加先增后減，在中等密度下(D2)活性較高。中等(N2)和高施氮量(N3)均能顯著的提高了SOD、CAT和POD的活性，說明了適當(dāng)增加種植密度或者增加氮肥量可以清除由于鹽分脅迫紫花苜蓿體內(nèi)的過量ROS，提高鹽堿地紫花苜蓿的抗逆性，緩解鹽分對紫花苜蓿的脅迫。