胡文靜，楊亞鵬，阿斯亞姆·阿布都克依木，葛瑞云，馬建暉，李克梅

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)林業(yè)和草原局，新疆烏魯木齊 830000）

苜蓿炭疽病在世界各苜蓿種植區(qū)普遍發(fā)生，美國(guó)[1]、意大利[2]、澳大利亞[3]、日本[4]、塞爾維亞[5]、巴基斯坦[6]、沙特阿拉伯[7]、伊朗[8]、阿根廷[9]、非洲南部[10]均有分布。我國(guó)主要分布在東北、西北、華北和西南(包括5個(gè)行政區(qū)和14個(gè)省)[11-12]等地。據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道，目前引起苜蓿炭疽病的病原菌有11種，分別為三葉草炭疽菌(Colletotrichum trifolii)、毀滅炭疽菌(C. destructivum)、平頭炭疽菌(C.truncatum)、束狀炭疽菌(C.dematium)、球炭疽菌(C.coccodes)[10]、菜豆炭疽菌(C.incanum)[12]、北美炭疽菌(C.americae-borealis)[13]、亞麻炭疽菌(C. linicola=C.lini)[14]、禾生炭疽菌(C. graminicola)[15]、菠菜炭疽菌(C. spinaciae)[16]和盤長(zhǎng)孢炭疽菌(C.gloeosporioides)[17]。其中，國(guó)內(nèi)報(bào)道的有6種，分別為亞麻炭疽菌[11]、三葉草炭疽菌、毀滅炭疽菌、平頭炭疽菌、北美炭疽菌和菜豆炭疽菌[12]。

三葉草炭疽菌(C.trifolii)是西瓜炭疽病菌復(fù)合種之一，病菌孢子萌發(fā)穿透角質(zhì)層或皮層侵入寄主細(xì)胞，引起寄主植物發(fā)生炭疽病[12]。該菌于1906年首次被發(fā)現(xiàn)侵染美國(guó)田納西州的三葉草(Trifolium)和苜蓿(Medicago)引起炭疽病[18]，我國(guó)最早于1966年報(bào)道在吉林該菌侵染紫花苜蓿(M. sativa)引起炭疽病[19]。三葉草炭疽菌侵染紫花苜蓿，可使感病苜蓿品種草產(chǎn)量降低25%～30%，嚴(yán)重時(shí)造成毀滅性危害[20]。徐杉[12]測(cè)定了三葉草炭疽菌、平頭炭疽菌、毀滅炭疽菌、北美炭疽菌和菜豆炭疽菌5種炭疽菌對(duì)紫花苜蓿種子、幼苗、植株的致病性，表明三葉草炭疽菌表現(xiàn)致病性最強(qiáng)，是引起紫花苜蓿炭疽病最為重要的病原菌。因此，抗三葉草炭疽菌的優(yōu)質(zhì)苜蓿品種篩選和推廣，是防治苜蓿炭疽病的有力措施。

炭疽菌的寄主范圍廣，侵染寄主發(fā)病后會(huì)造成產(chǎn)量損失、品質(zhì)下降等問(wèn)題，國(guó)內(nèi)關(guān)于各種作物對(duì)炭疽菌的抗病性評(píng)價(jià)做了大量研究。有學(xué)者開(kāi)展了山藥(Dioscorea opposita)[21]、梨(Pyrus spp)[22]、芒果(Mangifera indica)[23]、柑橘(Citrus reticulata)[24]、辣椒(Capsicum annuum)[25]、核 桃(Juglans regia)[26]、茶樹(shù)(Camellia sinensis)[27]、草莓(Fragaria ananassa)[28]、菜豆(Phaseolus vulgaris)[29]、亞麻(Linum usitatissimum)[30]等作物對(duì)炭疽病的抗性研究，得出不同作物品種之間對(duì)炭疽病的抗性存在差異，并據(jù)此篩選出相對(duì)抗病的品種資源。國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者針對(duì)苜蓿對(duì)炭疽菌的抗病性方面也開(kāi)展了相應(yīng)的研究工作，得到了系列抗炭疽病的苜蓿品種及種質(zhì)材料。采用室內(nèi)抗性測(cè)定法，鄭芳芳等[31]鑒定了20個(gè)紫花苜蓿品種對(duì)平頭炭疽菌(C. truncatum)的抗性，得到2個(gè)高抗苜蓿品種ProINTA Patricia 和Victoria SPI，5個(gè)中抗苜蓿品種Monarca SPI、SIMA593、13RSuperme、Victoria和CW701。馬甲強(qiáng)等[32]和辛寶寶等[33]分別測(cè)定了50個(gè)苜蓿種質(zhì)材料對(duì)亞麻炭疽菌的抗性，篩選出蘭熱來(lái)恩德、吐魯番、霍納伊、阿爾貢奎因、龍牧801、西奎爾、敖漢、沙灣、淮陰、咸陽(yáng)、運(yùn)城、博維和日本共13個(gè)高抗苜蓿種質(zhì)材料。采用田間抗性測(cè)定法，張梨梨等[34]開(kāi)展了44個(gè)紫花苜蓿品種對(duì)沙爾沁地區(qū)北美炭疽菌的抗性研究，篩選出14個(gè)抗病品種，其中WL343表現(xiàn)高抗，中苜2號(hào)、準(zhǔn)格爾、中草3號(hào)等13個(gè)品種表現(xiàn)中抗。Barnes等[20]比較了MSHp6、Cherokee、Vernal、Saranac、Iroquois共5種苜蓿材料對(duì)三葉草炭疽菌的抗性，得出MSHp6、Cherokee和Vernal對(duì)該菌抗性最好。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)紫花苜蓿品種及種質(zhì)材料對(duì)三葉草炭疽菌的抗病性評(píng)價(jià)的相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外40個(gè)紫花苜蓿品種開(kāi)展抗三葉草炭疽菌的苗期抗性評(píng)價(jià)，旨在為苜蓿炭疽病科學(xué)防治及抗炭疽病育種工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為HTB-2019-3，系新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草病害研究室從采自新疆呼圖壁縣紫花苜蓿田間病株分離獲得，描述其形態(tài)并分別擴(kuò)增了該菌株的核糖體核苷酸內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS、肌動(dòng)蛋白ACT、β-微管蛋白TUB2、組蛋白HIS3基因片段序列，經(jīng)形態(tài)特征比較結(jié)合聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定該菌株為三葉草炭疽菌(另文發(fā)表)。運(yùn)用孢子懸浮液噴霧接種法確定其對(duì)紫花苜蓿具有致病性，將菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試苜蓿品種

40個(gè)紫花苜蓿品種由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院李彥忠教授、河北加潤(rùn)草業(yè)有限公司李力爭(zhēng)總經(jīng)理、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境工程學(xué)院陳述民老師惠贈(zèng)。其中，國(guó)外品種23個(gè)，國(guó)內(nèi)品種17個(gè)(表1)。

表1 供試苜蓿品種及來(lái)源Table1 Alfalfa cultivarsand their sources

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苜蓿幼苗的培育

將園土、營(yíng)養(yǎng)土和蛭石按照1?3?1比例混合，裝入23 cm×16 cm(花盆高度× 花盆口徑)的花盆，澆水使之浸透，備用。挑選顆粒圓潤(rùn)飽滿、色澤鮮亮的苜蓿種子于培養(yǎng)皿中晾曬12 h，各材料做好標(biāo)記，用2%的次氯酸鈉將其浸泡2 min，再用無(wú)菌水清洗3次，均勻置于鋪有一層無(wú)菌濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于溫度20℃、相對(duì)濕度60%的恒溫培養(yǎng)箱中催芽。48 h 后移植于濕潤(rùn)的土壤中，土層厚度約1 cm[35-36]。培育至第2周時(shí)定苗，每盆留20株生長(zhǎng)健康的苜蓿幼苗。每個(gè)品種4 次重復(fù)。

1.2.2 菌種培養(yǎng)及接種

取新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草病害研究室保存的三葉草炭疽菌菌株HTB-2019-3，接種至PDA 培養(yǎng)平板，于25℃恒溫箱中培育14 d。待其產(chǎn)孢后，用玻片刮下培養(yǎng)基表層孢子，置無(wú)菌水中配制成濃度1 × 106spore·mL?1的孢子懸浮液，噴霧接種40 d 苗齡的紫花苜蓿植株[37]，每盆噴灑5 mL，使葉片完全濕潤(rùn)，25℃黑暗保濕培養(yǎng)24 h，后轉(zhuǎn)為12 h/12 h 光暗交替正常培育，每天觀察是否發(fā)病。每個(gè)苜蓿品種重復(fù)3次，以接種等量無(wú)菌水處理為對(duì)照。

1.2.3 病情分級(jí)與抗性評(píng)價(jià)

待供試苜蓿品種中感病品種最高發(fā)病率達(dá)100%時(shí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照李彥忠和南志標(biāo)[38]的方法并稍加修改：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，僅有小型水漬狀斑點(diǎn)；2級(jí)，病斑狹長(zhǎng)形，無(wú)或有少數(shù)分生孢子盤，但無(wú)成熟孢子；3級(jí)，病斑長(zhǎng)、寬，無(wú)環(huán)剝，通常具有分生孢子盤；4級(jí)，病斑大型，相互交匯，含大量分生孢子盤，莖稈最終環(huán)剝；5級(jí)，死亡。

抗性級(jí)別的劃分參照辛寶寶等[33]對(duì)苜蓿炭疽病抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定。病情指數(shù)小于11為高抗，在11～25為中抗，在25～35為中感，大于35為高感。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017統(tǒng)計(jì)測(cè)得的數(shù)據(jù)，以發(fā)病率和病情指數(shù)表示測(cè)定結(jié)果，利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)同一接種條件下的不同品種苜蓿發(fā)病率和病情指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿品種對(duì)炭疽病的抗性評(píng)價(jià)

經(jīng)室內(nèi)噴霧接種后第8天，40份供試苜蓿品種幼苗均感染炭疽病(表2)。植株發(fā)病率在6.67%～100.00%，病情指數(shù)在4.17～80.00。根據(jù)病情指數(shù)可分為高抗、中抗、中感、高感4個(gè)抗病級(jí)別，高抗品種與高感品種間差異顯著(P<0.05)。病情指數(shù)小于11的高抗品種有3個(gè)，占比7.50%，發(fā)病率在6.67%～10.00%，抗性高低依次為威納爾、阿爾岡金和巨能2。病情指數(shù)在11～25的中抗品種有7份，占比17.50%，發(fā)病率在23.23%～36.67%的品種分別為，WL363HQ、巨能7、拉迪諾、4030、4010、潤(rùn)布勒、亮牧。病情指數(shù)在25～35的中感品種有新牧4號(hào)、甘農(nóng)4號(hào)、馴鹿等15份，占比37.50%，發(fā)病率在36.67%～63.33%的品種有21個(gè)，例如甘農(nóng)4號(hào)，3010等。病情指數(shù)大于35的高感品種有新疆大葉、甘農(nóng)6號(hào)、甘農(nóng)9號(hào)等15份，占比37.50%；其中，新疆大葉發(fā)病率高達(dá)100.00%，病情指數(shù)達(dá)80。

表2 苜蓿品種對(duì)三葉草炭疽菌抗性的室內(nèi)鑒定結(jié)果Table 2 Results of alfalfa varieties Colletotrichum trifolii resistance assays performed in a greenhouse

2.2 接菌后不同發(fā)病程度炭疽病癥狀描述

苗齡40 d 的紫花苜蓿接種三葉草炭疽菌后第6 天，30.1%的供試苜蓿植株莖稈出現(xiàn)1～40 mm 大小不等的淡褐色水漬狀病斑。接種后第8天，所有供試品種均被侵染，表現(xiàn)不同程度發(fā)病癥狀，重者莖稈折斷，甚至枯死，整體發(fā)病率為47.5%。其中，高感品種癥狀多表現(xiàn)為莖稈上出現(xiàn)褐色棱形至長(zhǎng)條形病斑，上生褐色(分生孢子盤)至黑色(微菌核)小點(diǎn)，病斑繞莖一周，導(dǎo)致莖稈折斷呈“牧羊杖”狀，莖稈上部枯死(圖1A、B)，如品種新疆大葉(圖2A)。中感品種癥狀多表現(xiàn)為莖稈和葉柄有褐色卵圓形病斑，葉柄干枯，葉片脫落，少數(shù)病斑有分生孢子盤(圖1C)，如品種沖擊波(圖2B)。中抗品種癥狀多表現(xiàn)為在莖稈或葉柄處有淡褐色、無(wú)分生孢子盤的圓形至卵圓形病斑，完全健康和死亡的植株很少(圖1D)，如品種WL363HQ(圖2C)。高抗品種癥狀大多表現(xiàn)為無(wú)病斑或僅有水漬狀斑點(diǎn)，未見(jiàn)分生孢子盤，生長(zhǎng)狀況良好(圖1E)，如品種威納爾(圖2D)。健康植株無(wú)病斑(圖1F)。

圖1 不同發(fā)病程度植株癥狀圖Figure 1 Symptoms of plants with different disease severity

圖2 四類不同抗病性的代表性苜蓿品種發(fā)病癥狀Figure 2 Symptoms in four representative alfalfa cultivars with different disease resistance levels

3 討論與結(jié)論

選用和推廣抗病品種是防治苜蓿炭疽病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，開(kāi)展苜蓿品種對(duì)炭疽病的抗性評(píng)價(jià)研究對(duì)苜蓿炭疽病的防治有重要的應(yīng)用價(jià)值。不同炭疽病菌侵染苜蓿的主要部位有差異，平頭炭疽菌[31]和亞麻炭疽菌[32-33]主要侵染苜蓿葉片，北美炭疽菌和三葉草炭疽菌主要侵染苜蓿莖稈[12]。本研究采用三葉草炭疽菌菌株HTB-2019-3接種40個(gè)苜蓿品種，發(fā)現(xiàn)該菌可侵染苜蓿莖稈和葉柄，與徐杉[12]測(cè)定的三葉草炭疽菌新疆菌株XJLYZ15和XJLYZ16僅染莖稈的研究結(jié)果略有差異，這可能是由于不同菌株間存在致病性差異導(dǎo)致。張梨梨等[34]開(kāi)展44個(gè)苜蓿品種對(duì)北美炭疽菌的抗性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，在接種后14 d，全部苜蓿品種感染炭疽病，高感品種新疆大葉的發(fā)病率為47.31%。本研究開(kāi)展40個(gè)苜蓿品種對(duì)三葉草炭疽菌的抗性評(píng)價(jià)，在接種第6天，大約30%的苜蓿品種出現(xiàn)病斑，接種第8天，供試苜蓿品種全部感染炭疽病，高感品種新疆大葉發(fā)病率高達(dá)100%。據(jù)此推測(cè)，三葉草炭疽菌或許比北美炭疽菌侵染力更強(qiáng)，病情發(fā)展更快，擴(kuò)散更迅速，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致苜蓿死亡。

在美國(guó)東部、中部、西部苜蓿種植區(qū)中，種植抗三葉草炭疽菌苜蓿品種Beltsville 1-An4、Beltsville 2-An4，Beltsville 3-An4和Arc能夠顯著提高苜蓿草年產(chǎn)量[39]，其中，有24個(gè)地區(qū)苜蓿草年平均產(chǎn)量提高7%，有15個(gè)地區(qū)苜蓿草年平均產(chǎn)量提高10%。因此，在炭疽病發(fā)生嚴(yán)重的地區(qū)種植抗病品種可經(jīng)濟(jì)安全地減少產(chǎn)量損失，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。

苗期抗性鑒定法省工省時(shí)，可在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量植物材料的比較和篩選，且在室內(nèi)進(jìn)行，不受生長(zhǎng)季節(jié)和自然條件的限制，但不利于測(cè)定不同發(fā)育階段的抗性變化[40]。本研究采用苗期鑒定法開(kāi)展了40份苜蓿品種對(duì)炭疽病的苗期抗病性評(píng)價(jià)，研究結(jié)果尚不能完全準(zhǔn)確反映苜蓿整個(gè)生育期對(duì)三葉草炭疽菌的抗性，后續(xù)將進(jìn)一步開(kāi)展田間抗性評(píng)價(jià)以便更好地服務(wù)生產(chǎn)。

本研究篩選出威納爾、巨能2、阿爾岡金、WL363HQ、巨能7、拉迪諾、4030、4010、潤(rùn)布勒、亮牧10個(gè)抗病品種；且發(fā)現(xiàn)，三葉草炭疽菌新疆菌株HTB-2019-3 僅侵染苜蓿莖稈和葉柄引起炭疽病，且該菌致病力極強(qiáng)，擴(kuò)散迅速，說(shuō)明新疆具備苜蓿炭疽病發(fā)生和流行的有力條件。應(yīng)盡快開(kāi)展針對(duì)三葉草炭疽菌新疆菌株的抗炭疽病苜蓿育種及苜蓿炭疽病綠色防控技術(shù)研發(fā)，助力新疆畜牧業(yè)健康有序發(fā)展。本研究結(jié)果在以三葉草炭疽菌為主的地區(qū)推廣抗炭疽病苜蓿品種以防治苜蓿炭疽病提供了參考依據(jù)。