涂杰 沈艷 劉曉敏 武健 董旭 朱偉華 張勇

摘要 [目的]評(píng)價(jià)97%氰氟草酯原藥對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性和生物富集效應(yīng)。[方法]參考《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》，測(cè)定97%氰氟草酯原藥對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性和生物富集效應(yīng)，計(jì)算半效應(yīng)濃度LC 50和生物富集系數(shù)BCF。[結(jié)果]97%氰氟草酯原藥對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性為中毒，生物富集等級(jí)屬于中等富集性。[結(jié)論]在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，氰氟草酯應(yīng)嚴(yán)格控制其用量，盡可能減少對(duì)斑馬魚(yú)和水生生態(tài)系統(tǒng)的危害。

關(guān)鍵詞 氰氟草酯;斑馬魚(yú);急性毒性;生物富集

中圖分類號(hào) X 503.225? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）18-0084-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.021

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Acute Toxicity and Bioconcentration of Cyhalofop-butyl in Brachydanio rerio

TU Jie1，2， SHEN Yan2， LIU Xiao-min2 et al

（1.Hefei University， Hefei，Anhui? 230031;2.Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei，Anhui? 230031）

Abstract [Objective] To evaluate the acute toxicity and bioenrichment effects of 97% cyhalofop-butyl on Brachydanio rerio. [Method] The acute toxicity and bioaccumulation effect of 97% cyhalofop-butyl on? Brachydanio rerio were determined. The median effective concentration LC 50 and bioconcentration factor BCF were calculated by reference to Test Guidelines on Environmental Safety Assessment for Chemical Pesticides. [Result] The acute toxicity of 97% cyhalofop-butyl on Brachydanio rerio was middle toxic;cyhalofop-butyl was a kind of medium bioconcentration pesticide. [Conclusion] The cyhalofop-butyl should be strictly controlled to minimize the damage to zebrafish and aquatic ecosystem.

Key words Cyhalofop-butyl;Brachydanio rerio;Acute toxicity;Bioaccumulation

作者簡(jiǎn)介 涂杰（1993—），男，安徽安慶人，碩士研究生，研究方向：農(nóng)藥環(huán)境毒理。

*通信作者，副研究員，從事除草劑、殺菌劑藥效及安全性評(píng)價(jià)研究。

收稿日期 2020-12-21;修回日期 2021-02-19

我國(guó)是世界范圍內(nèi)最大的農(nóng)藥生產(chǎn)國(guó)和使用國(guó)之一，每年施用大量的化學(xué)農(nóng)藥用于防治農(nóng)作物病蟲(chóng)草害[1]。2015年農(nóng)業(yè)部公布我國(guó)農(nóng)藥利用率僅為36.6%[2]。其余大部分未被利用的化學(xué)農(nóng)藥則進(jìn)入自然環(huán)境中，不僅對(duì)水體、土壤等生態(tài)系統(tǒng)造成污染，也會(huì)導(dǎo)致非靶生物受到不同程度的毒害作用。

水生生物是在農(nóng)藥污染的水環(huán)境中的非靶標(biāo)生物[1]。魚(yú)類作為水生生物中的重要物種，所受到的農(nóng)藥污染危害最大，水質(zhì)污染會(huì)對(duì)漁業(yè)造成巨大損失[3]。藍(lán)色斑馬魚(yú)是一種小型雜食性淡水熱帶魚(yú)，成魚(yú)體長(zhǎng)3～4 cm，染色體數(shù)為50條[4]。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，對(duì)水質(zhì)要求不高，水溫25～31 ℃為宜，pH 7～8為最適宜[5]。因此，ISO和OECD已將斑馬魚(yú)作為毒理學(xué)測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)的推薦測(cè)試物種，用于測(cè)試化合物對(duì)生物體的毒性。目前研究最多的是斑馬魚(yú)的急性毒性試驗(yàn)。

氰氟草酯是水稻田應(yīng)用最廣泛的除草劑之一，目前因用量大而使雜草對(duì)其產(chǎn)生抗性，其對(duì)水生物及水體環(huán)境的影響同樣值得關(guān)注。筆者選用97%氰氟草酯原藥，研究其對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性和生物富集效應(yīng)，旨在為更全面評(píng)價(jià)氰氟草酯在環(huán)境中的安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)生物

藍(lán)色斑馬魚(yú)（Brachydanio rerio），購(gòu)自合肥市裕豐花鳥(niǎo)蟲(chóng)魚(yú)市場(chǎng)。試驗(yàn)用水，曝氣自來(lái)水（24 h以上），水溫為21～25 ℃，pH為6.0～8.5，溶解氧含量不低于空氣飽和值的60%，水質(zhì)硬度為10～250 mg/L（以CaCO 3計(jì)）。試驗(yàn)前預(yù)養(yǎng)7 d（與試驗(yàn)相同的環(huán)境條件下），且試驗(yàn)前24 h內(nèi)不喂食。

1.2 試驗(yàn)藥劑

97%氰氟草酯原藥由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所提供。氰氟草酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司。99.8%重鉻酸鉀、助溶劑丙酮（分析純）、乳化劑吐溫-80等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸均為色譜純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

萬(wàn)分之一電子天平、溫度計(jì)、水質(zhì)硬度計(jì)、溶解氧分析儀、移液器、便攜式pH計(jì)、日本島津SHIMADZULCMS-8030液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、高速離心機(jī)、渦旋振蕩器等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)。

采用半靜態(tài)法研究97%氰氟草酯原藥對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性效應(yīng)[6]。設(shè)置2.000、2.500、3.125、3.906、4.883、6.104、7.629 mg/L 7個(gè)濃度組，同時(shí)設(shè)空白和助溶劑對(duì)照組，每隔24 h更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)時(shí)，先向試驗(yàn)魚(yú)缸內(nèi)加入經(jīng)活性炭吸附后的曝氣自來(lái)水配制的各試驗(yàn)溶液，然后將預(yù)養(yǎng)的斑馬魚(yú)放入試驗(yàn)魚(yú)缸內(nèi)，每缸7條，不設(shè)重復(fù)。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)及每隔24 h觀察魚(yú)死亡和中毒狀況，并測(cè)定各處理濃度和空白對(duì)照魚(yú)缸內(nèi)水的pH、溶氧量及溫度等。

1.4.2 斑馬魚(yú)生物富集試驗(yàn)。

采用半靜態(tài)法研究97%氰氟草酯原藥對(duì)斑馬魚(yú)的生物富集效應(yīng)[7]。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)的96 h-LC 50，設(shè)置3.9×10-2 mg/L（1/100）和0.39 mg/L（1/10）2個(gè)濃度組，同時(shí)設(shè)空白和助溶劑對(duì)照組。每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)40條魚(yú)。每隔24 h更換試驗(yàn)藥液，并于0、24、48、96、144、192 h從各處理組中取50 mL試驗(yàn)藥液和5條魚(yú)樣，用于檢測(cè)其中的供試藥物及其代謝產(chǎn)物的含量，同時(shí)測(cè)定pH、水溫、溶解氧含量等并觀察魚(yú)中毒和死亡情況。

1.4.3 樣品前處理。

水樣：取2.000 mL離心后的水樣至10 mL塑料離心管，加入2.000 mL色譜純乙腈，渦旋混勻1 min，靜置10 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

魚(yú)樣：稱取已勻漿試樣2 g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈溶液，振蕩提取40 min，加入1～2 g氯化鈉，振搖2 min，以5 000 r/min離心3 min，取上層溶液2 mL過(guò)0.22 μm有機(jī)系微孔膜，待測(cè)。

1.4.4

儀器分析方法。SHIMADZULCMS-8030液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)條件：色譜柱Shim-pack XR-ODS-Ⅲ，2.0 mm×50 mm，1.6 μm;流動(dòng)相A-5 mmol/L乙酸銨水溶液+0.02%甲酸;B-甲醇;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣體積2 μL;柱溫40 ℃。

1.4.5

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。用甲醇配制1.000、0.800、0.500、0.100、0.080、0.050、0.010、0.005 mg/L氰氟草酯標(biāo)準(zhǔn)品系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按上述條件進(jìn)樣分析，以濃度-峰面積繪制氰氟草酯標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=17 993x+61.584，r2=0.994 1。用甲醇配制1.000、0.800、0.400、0.100、0.080、0.040、0.010、0.008 mg/L氰氟草酸標(biāo)準(zhǔn)品系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按上述條件進(jìn)樣分析，以濃度-峰面積繪制氰氟草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=89 109x-459.7，r2=0.999 6。結(jié)果表明，氰氟草酯和氰氟草酸分別在0.005～1.000 mg/L和0.008～1.000 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.4.6

氰氟草酯和氰氟草酸在水樣中添加回收率測(cè)定。分別向試驗(yàn)用水中添加氰氟草酯和氰氟草酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均配制為0.2、0.5、1.0 mg/L，采用上述前處理方法和儀器分析方法，測(cè)定試驗(yàn)溶液濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。氰氟草酯平均回收率為81.6%～85.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.8%～2.8%;氰氟草酸平均回收率為79.0%～82.4%，RSD為2.3%～3.7%。

1.4.7

氰氟草酯和氰氟草酸在魚(yú)樣中添加回收率測(cè)定。在魚(yú)樣中分別添加氰氟草酯和氰氟草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，均配制為0.01和0.50 mg/L 2個(gè)添加濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。氰氟草酯平均回收率為85.8%～86.0%，RSD為3.5%～3.8%;氰氟草酸平均回收率為78.7%～81.7%，RSD為2.7%～3.9%。

1.5 數(shù)據(jù)方法

統(tǒng)計(jì)分析：用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0計(jì)算斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)LC 50及95%置信區(qū)間。

氰氟草酯殘留總量計(jì)算方法：氰氟草酯總量=氰氟草酯含量+氰氟草酸含量×R，其中系數(shù)R=1.186為母體分子量與代謝物分子量比值。

生物富集系數(shù)（BCF）計(jì)算公式為BCF = Cfs /Cws，其中，Cfs為平衡時(shí)魚(yú)體內(nèi)的供試物含量，Cws為平衡時(shí)水體中的供試物含量。依據(jù)《準(zhǔn)則》判定氰氟草酯對(duì)斑馬魚(yú)的毒性等級(jí)與生物富集等級(jí)（表1、2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 參比試驗(yàn)結(jié)果

為了解選用斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)狀況及敏感性情況，試驗(yàn)之前用重鉻酸鉀進(jìn)行斑馬魚(yú)參比試驗(yàn)。重鉻酸鉀對(duì)斑馬魚(yú)的參比試驗(yàn)結(jié)果顯示，其半效應(yīng)濃度24 h-LC 50為245.515 mg/L，95%置信限為212.990～284.946 mg/L。

2.2 氰氟草酯對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性

試驗(yàn)過(guò)程中空白對(duì)照組以及助溶劑對(duì)照組的斑馬魚(yú)死亡情況與試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)比較無(wú)明顯變化。根據(jù)97%氰氟草酯原藥對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，按照理論濃度計(jì)算，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0分析其半致死濃度96 h-LC 50和95%置信限。97%氰氟草酯原藥對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性的96 h-LC 50為3.964 mg/L，95%置信限為3.327～4.737 mg/L（表3）。試驗(yàn)結(jié)果的毒性等級(jí)參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》進(jìn)行劃分，97%氰氟草酯原藥對(duì)斑馬魚(yú)毒性等級(jí)為“中毒”。

2.3 氰氟草酯對(duì)斑馬魚(yú)的生物富集效應(yīng)

根據(jù)97%氰氟草酯原藥對(duì)斑馬魚(yú)的生物富集性試驗(yàn)結(jié)果，按照生物富集系數(shù)計(jì)算公式，97%氰氟草酯原藥96 h-LC 50的1/100試驗(yàn)處理組中，6 d時(shí)水體及魚(yú)體中氰氟草酯含量達(dá)到平衡，斑馬魚(yú)對(duì)氰氟草酯的生物富集系數(shù)（BCF 6d）為16.3（表4）。97%氰氟草酯原藥96 h-LC 50的1/10試驗(yàn)處理組中，6 d時(shí)水體及魚(yú)體中氰氟草酯含量達(dá)到平衡，斑馬魚(yú)對(duì)氰氟草酯的生物富集系數(shù)（BCF 6d）為28.6（表5）。依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中的標(biāo)準(zhǔn)，判斷氰氟草酯對(duì)斑馬魚(yú)的富集效應(yīng)等級(jí)為中等富集性。

3 結(jié)論與討論

魚(yú)類不僅是生態(tài)系統(tǒng)中的重要生物，也是人類的主要食物之一，農(nóng)藥的合理施用對(duì)魚(yú)類的生存乃至人類的健康至關(guān)重要。因此，農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類的毒性評(píng)價(jià)工作一直是農(nóng)藥環(huán)境評(píng)價(jià)的重點(diǎn)[8]。斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)是檢測(cè)環(huán)境污染物急性毒性的常用方法之一[1]。而魚(yú)類生物富集試驗(yàn)對(duì)農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及其慢性毒性研究具有非常重要的意義[9]。吳遲等[10]和李如美等[11]分別研究了戊唑醇和葉菌唑?qū)Π唏R魚(yú)的急性毒性及生物富集效應(yīng)，均表明農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)有一定的毒害效應(yīng)。

該研究選用97%氰氟草酯原藥，研究了其對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性和生物富集效應(yīng)。結(jié)果表明，97%氰氟草酯原藥對(duì)魚(yú)類急性毒性表現(xiàn)為中等毒性，生物富集性為中等富集性。

近年來(lái)，除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的使用量逐年增大，不同種類除草劑對(duì)水生生物的研究也越來(lái)越受到重視。廖藝鈺等[12]研究了草甘膦農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)的毒性，急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明草甘膦屬于高毒農(nóng)藥;研究表明，西草凈對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性為中毒[13]，五氟磺草胺對(duì)3月齡幼魚(yú)也表現(xiàn)為中等毒性[14];Al-Sawafi等[15]將斑馬魚(yú)分別暴露在0.957、1.913 mg/L 的莠去津藥液中，結(jié)果表明斑馬魚(yú)能迅速富集該除草劑;何健等[16]報(bào)道了二甲四氯和二甲四氯異辛酯在斑馬魚(yú)體內(nèi)均有富集效應(yīng)。這表明除草劑對(duì)斑馬魚(yú)有一定的毒性并能在魚(yú)體內(nèi)不同程度的富集。

該研究是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的，氰氟草酯作為水稻田除草劑在水田施用，不可避免會(huì)進(jìn)入水體，自然環(huán)境下農(nóng)藥的毒性效應(yīng)更為復(fù)雜。若要更全面地評(píng)估該除草劑在魚(yú)體內(nèi)的累積毒性及對(duì)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)，仍需進(jìn)一步開(kāi)展魚(yú)類生命周期或水生生態(tài)模擬系統(tǒng)等方面的研究。因此氰氟草酯在田間使用時(shí)，仍應(yīng)注意選擇毒性較低的劑型，嚴(yán)格控制用藥量等，科學(xué)合理的使用，盡量減少其對(duì)水體環(huán)境以及水生物的影響。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱麗珍.兩種芳氧苯氧基丙酸酯類除草劑對(duì)斑馬魚(yú)毒性效應(yīng)及作用機(jī)制研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[2] 吳向輝，何難.農(nóng)業(yè)部首次公布化肥，農(nóng)藥利用率數(shù)據(jù)[J].農(nóng)化市場(chǎng)十日訊，2016（3）：7.

[3] 鐘文武，王文玉，孫昳，等.云南省淡水漁業(yè)環(huán)境現(xiàn)狀及保護(hù)對(duì)策[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（17）：290-292.

[4] 徐立利，徐永學(xué)，閆艷春.斑馬魚(yú)及其胚胎在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010（11）：35-39.

[5] 李潔斐，李衛(wèi)華，金泰廙，等.斑馬魚(yú)及其在環(huán)境毒理學(xué)中的應(yīng)用[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2005，22（5）：460-463.

[6] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則 第12部分：魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)：GB/T 31270.12—2014[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2015.

[7] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則 第7部分：生物富集試驗(yàn)：GB/T 31270.7—2014[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2015.

[8] 鄒積鑫，何雄奎，陶傳江，等.乙羧氟草醚對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性和生物富集性研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，8（4）：375-378.

[9] 劉娜.戊唑醇等3種典型三唑類手性農(nóng)藥在斑馬魚(yú)中的選擇性生物富集及生物毒性差異[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：53-64.

[10] 吳遲，劉新剛，何明遠(yuǎn)，等.戊唑醇對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性及生物富集效應(yīng)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017，12（4）：302-309.

[11] 李如美，戴爭(zhēng)，王維，等.葉菌唑?qū)Π唏R魚(yú)的急性毒性及生物富集效應(yīng)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2019，14（5）：326-330.

[12] 廖藝鈺，惠呂佳，嚴(yán)吉祥，等.草甘膦農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性和慢性毒性研究[J].廣州化工，2020，48（21）：66-68.

[13] 蔣利生，吳曉峰，康杰.西草凈對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（18）：63-64，69.

[14] 朱少杰，臧傳江，李晨雨，等.五氟磺草胺對(duì)斑馬魚(yú)的毒性效應(yīng)[J].農(nóng)藥，2019，58（8）：601-603.

[15] AL-SAWAFI A G A，YAN Y J.Bioconcentration and antioxidant status responses in zebrafish（Danio rerio）under atrazine exposure [J].International journal of chemical engineering and applications，2013，4（4）：204-208.

[16] 何健，周艷，孔德洋，等.2甲4氯和2甲4氯異辛酯在斑馬魚(yú)體內(nèi)生物富集性[J].農(nóng)藥，2015，54（11）：822-824.