吳慶和， 楊昌河

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510120）

《中國心血管病報告2018》[1]指出，我國心血管病患病人數(shù)高達2.9億，其中冠狀動脈粥樣硬化型心臟?。ü谛牟。┗颊哌_1 100萬，而隨著經(jīng)濟社會的不斷發(fā)展，存在冠心病危險因素的人群不斷擴大，患病人數(shù)仍將持續(xù)上升。冠心病已然成為不可忽視的重大健康問題，這其中，急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）作為冠心病的危重類型，有著較高的致死率和致殘率，如何篩選出可能的危險因素并加以早期干預(yù)是重要的研究課題。諸多研究表明，載脂蛋白E（ApoE）基因型多態(tài)性被認為是冠心病的獨立危險因素[2]，然而，對于ApoE基因多態(tài)性是否與急性心肌梗死相關(guān)尚存在爭議[3]，關(guān)于STEMI與ApoE基因多態(tài)性的關(guān)系亦未明確?；诖耍狙芯恐荚谔骄縎TEMI患者ApoE基因多態(tài)性、血脂水平及其與痰瘀證候的相關(guān)性，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象采用回顧性病例對照研究方法，檢索廣東省中醫(yī)院胸痛中心管理系統(tǒng)，篩選2018年1月至2020年10月在廣東省中醫(yī)院急診就診或經(jīng)120救護系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至廣東省中醫(yī)院的痰瘀證STEMI患者作為觀察組。所有患者均行急診冠狀動脈造影術(shù)，且造影結(jié)果提示至少存在1支心外膜冠狀動脈或其主要分支狹窄50%以上（排除冠狀動脈肌橋），并根據(jù)患者臨床特點及病變嚴重程度行單純冠脈造影術(shù)、冠狀動脈球囊擴張和（或）支架植入術(shù)。按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)兩名研究者分別復(fù)核后，共收集STEMI患者82例，其中男性65例，女性17例，年齡（62.9±12.7）歲。同時，收集同期在廣東省中醫(yī)院就診的經(jīng)體質(zhì)辨識認定為痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、瘀血質(zhì)的健康體檢者，經(jīng)年齡及性別匹配后作為對照組，共112例，其中男性90例，女性22例，年齡（62.0±12.6）歲，此部分受試者均無明顯胸悶痛、心酶和心電圖特征性變化等冠心病臨床表現(xiàn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)STEMI診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《急性ST段抬高型心肌梗死診斷與治療指南（2019）》[4]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：參照《中醫(yī)內(nèi)科病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]中的相關(guān)辨證標(biāo)準(zhǔn)。對照組體質(zhì)辨識參照《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》[6]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 病例納入標(biāo)準(zhǔn)①于2018年1月至2020年10月在廣東省中醫(yī)院急診就診或經(jīng)120救護系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至廣東省中醫(yī)院就診，明確診斷為STEMI；②中醫(yī)證型屬于痰瘀證；③病歷資料完整；④年齡≤85歲；⑤與其他研究個體不存在血緣關(guān)系；⑥知情并愿意配合ApoE基因型檢測的患者。

1.3.2 對照組納入標(biāo)準(zhǔn)①于2018年1月至2020年10月在廣東省中醫(yī)院體檢；②無明顯胸悶痛、心酶和心電圖特征性變化等冠心病臨床表現(xiàn)；③中醫(yī)體質(zhì)類型為痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、瘀血質(zhì)；④年齡≤85歲；⑤與其他研究個體不存在血緣關(guān)系；⑥知情并愿意配合ApoE基因型檢測者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)所有研究對象（包括觀察組和對照組），若出現(xiàn)以下任意一項者均予以排除：①不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；②年齡＞85歲者；③與其他個體存在血緣關(guān)系者；④不愿意配合ApoE基因型檢測者；⑤患有缺血性腦卒中[7]、嚴重的肝腎功能異常、家族性高脂血癥、惡性腫瘤以及免疫系統(tǒng)疾病的患者。

1.5 儀器和試劑載脂蛋白E（ApoE）基因型檢測試劑盒（基因芯片法）、PCR擴增儀（ABI2720）、基因芯片閱讀儀（Sinochips-PGA）均由珠海賽樂奇生物技術(shù)有限公司提供。ApoE基因型檢測由廣東省中醫(yī)院中心實驗室分子診斷組完成，其他血液生化指標(biāo)由廣東省中醫(yī)院檢驗科進行檢測。

1.6 研究方法

1.6.1 臨床資料采集及血生化檢測患者病史由首診醫(yī)生及時采集并進行體格檢查，包括性別、年齡、現(xiàn)病史、既往史、家族史、吸煙史、飲酒史、身高、體質(zhì)量等，緊急手術(shù)患者為術(shù)后補充采集，空腹8 h后于次日清晨進行靜脈血采集，檢測甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、肝腎功能等。

1.6.2 ApoE基因型檢測方法應(yīng)用基因芯片法，即采用ApoE基因檢測試劑盒（國械注準(zhǔn)20173400132）進行ApoE基因型檢測。檢測原理：PCR擴增特定基因片段與芯片上特異性核酸探針雜交檢測特定的基因位點序列，放大基因芯片雜交信號至肉眼判讀的水平，判讀112位和158位基因類型。具體操作步驟參照說明書[8]。

1.6.2.1 樣品處理 經(jīng)過反復(fù)震蕩、離心后洗脫的DNA儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2.2 目的片段的PCR擴增 ①取PCR反應(yīng)液，在室溫（25℃）下融化離心10 s；②取制備樣品加入PCR管中；③將PCR擴增管離心；④PCR擴增：95℃變性10 min；94℃，30 s→56℃，30 s→72℃，30 s，進行40個循環(huán)；72℃延伸5 min后于4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2.3 基因芯片檢測 擴增產(chǎn)物經(jīng)變性、雜交、顯色、離心、干燥后，應(yīng)用自動分析報告系統(tǒng)判讀基因型。

1.6.2.4 試驗有效性判定（ApoE基因型檢測芯片陰陽性判定）使用基因芯片閱讀儀檢測，相應(yīng)位點的信號灰度值與背景灰度值差≥4判定結(jié)果為陽性，反之，＜4判定為陰性。ApoE基因型判定結(jié)果如圖1。

圖1 ApoE基因型判定Figure 1 ApoE genotype determination

1.7 統(tǒng)計方法應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計量資料采用Kolmogorov-Smironov檢驗進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布者用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析；不符合正態(tài)分布者用中位數(shù)和四分位間距[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用兩獨立樣本W(wǎng)ilcoxon符號秩和檢驗。計數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間比較采用卡方檢驗及單因素Logistics回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組ApoE基因多態(tài)性比較表1結(jié)果顯示：本研究共檢測到ApoE基因型5種，未發(fā)現(xiàn)E2/2基因型，其中觀察組基因型頻率分別為E2/3型15.8%，E2/4型1.2%，E3/3型73.1%，E3/4型8.5%，E4/4型1.2%，而對照組只發(fā)現(xiàn)E2/3型、E3/3型、E3/4型3種基因型，頻率分別為17.8%、70.5%、11.6%。觀察組與對照組中，均以基因型E3/3頻率和表現(xiàn)型E3等位基因頻率最高，均大于70%。因E2/4、E4/4基因型頻數(shù)較低，未納入統(tǒng)計檢驗。2組間各基因型和表現(xiàn)型比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示STEMI與ApoE基因型及表現(xiàn)型并無顯著性相關(guān)。

表1 觀察組與對照組ApoE基因型多態(tài)性比較Table 1 Comparison of ApoE genotype polymorphism between observation group and control group [例（%）]

2.2 2組血脂水平比較表2結(jié)果顯示：雖然基因型之間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，但血脂水平與基因多態(tài)性的數(shù)據(jù)并不一致。觀察組TC、LDL-C水平明顯高于對照組，HDL-C水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示脂質(zhì)異?？赡苁菍?dǎo)致STEMI的危險因素之一，這與既往研究[9]結(jié)論一致；而2組間TG水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 觀察組與對照組血脂水平比較Table 2 Comparison of serum blood lipid levels between observation group and control group[M（Q1，Q3），mmol·L-1]

2.3 觀察組不同證型患者基因多態(tài)性比較表3結(jié)果顯示：觀察組STEMI患者以瘀證為主，占63.4%（52/82）。其中，E3/4基因型或E4表現(xiàn)型患者以痰證表現(xiàn)為主，而E3/3基因型和E3表現(xiàn)型患者以瘀證表現(xiàn)為主，E3/4基因型患瘀證的概率是E3/3型的0.17倍[OR=0.17，95%CI=（0.03，0.96）]，E4表現(xiàn)型患瘀證的概率是E3型的0.15倍[OR=0.15，95%CI=（0.03，0.82）]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而E2/3基因型和E2表現(xiàn)型組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 觀察組不同證型急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者基因多態(tài)性比較Table 3 Comparison of gene polymorphisms in patients with different syndromes of acute STEMIin observation group [例（%）]

3 討論

冠心病是在多種因素作用下的冠狀動脈粥樣硬化形成，進而使冠狀動脈狹窄或閉塞或功能性改變，從而導(dǎo)致心肌缺血、缺氧甚至壞死的一類疾病。其中的急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）是其嚴重類型，而絕大多數(shù)的STEMI與不穩(wěn)定的冠狀動脈斑塊破裂有關(guān)。對于冠狀動脈粥樣硬化的形成有各種各樣的假說，“脂質(zhì)浸潤學(xué)說”就是其中的一種。已經(jīng)有大量研究表明，異常的脂質(zhì)代謝對冠心病的形成、發(fā)展及預(yù)后危害極大。作為維持和調(diào)控血脂代謝平衡有重要作用的載脂蛋白E（ApoE）及其基因多態(tài)性自然成為了冠心病的研究熱點之一。ApoE基因位于第19號染色體長臂1區(qū)3帶2亞帶（19q13.2）[3]上，共產(chǎn)生E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4、E4/4等6種主要基因型。一般認為，ApoE3為野生型，占比最高，達60%以上[10]，這也與本研究的70%以上占比相符。有研究[11]表明，ApoE基因可影響14%～16%的血中膽固醇水平。隨著研究的不斷深入，ApoE基因多態(tài)性也被認為是冠心病的獨立危險因素[12]之一；同時，ApoE4等位基因還被認為與冠脈病變嚴重程度[13]、支架內(nèi)再狹窄（ISR）[14]、早發(fā)冠心病[15]、冠心病痰瘀證候[16]等相關(guān)。然而，在心肌梗死方面并未取得一致意見[17-18]。關(guān)于STEMI發(fā)病與ApoE基因多態(tài)性的關(guān)系鮮有人提及，其中醫(yī)證型與ApoE基因多態(tài)性的研究則更少。

中醫(yī)理論認為，胸痹的病機是“陽微陰弦”，真心痛作為胸痹重癥，“本虛標(biāo)實”亦是被學(xué)術(shù)界所公認的病機。在標(biāo)實方面，既往研究[19-20]表明，真心痛之證型多以氣滯、痰凝、血瘀為標(biāo)；而易建新[21]、曾吉祥等[22]在證素方面的研究中發(fā)現(xiàn)，血瘀、痰濁為最常見的中醫(yī)證素。而縱觀當(dāng)前對真心痛的治療，大多以活血化瘀為主而少以痰證為主進行治療。

基于此，本研究以符合痰瘀證辨證的STEMI患者作為觀察組，并與健康體檢者的對照組相比較，進一步探討STEMI患者的ApoE基因多態(tài)性分布和血脂水平情況，以及痰證和瘀證不同中醫(yī)證素與ApoE基因多態(tài)性分布的關(guān)系。研究結(jié)果表明，觀察組與對照組中E3等位基因頻率最高，分別為74.2%、70.5%，與既往研究相符。而2組間各基因型和各表現(xiàn)型比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。然而，值得注意的是，在ApoE基因多態(tài)性無顯著性差異的情況下，2組的血脂水平依然呈現(xiàn)出了顯著性差異，其中觀察組的TC、LDL-C水平明顯高于對照組，而HDL-C水平則明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明脂質(zhì)異?？赡苁翘叼鲎CSTEMI患者發(fā)病的危險因素，而并非負責(zé)編碼、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的ApoE基因，這與部分研究[17]認為ApoE基因多態(tài)性是急性心肌梗死危險因素的研究結(jié)論并不一致。另外，在痰瘀證素研究方面，STEMI患者以瘀證表現(xiàn)為主，占63.4%（52/82），但在具有E4等位基因的患者中，以痰證居多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示E4表現(xiàn)型，尤其E3/4基因型可能與STEMI患者痰證相關(guān)，而E3/3基因型及E3表現(xiàn)型可能與瘀證相關(guān)。

ApoE基因多態(tài)性研究是精準(zhǔn)醫(yī)療的縮影之一，也是中醫(yī)“治未病”思想的重要體現(xiàn)。本研究結(jié)果表明，STEMI痰瘀證患者發(fā)病可能與ApoE基因多態(tài)性并不相關(guān)，而與脂質(zhì)代謝異常相關(guān)。由此可推斷，當(dāng)存在ApoE4等位基因時，良好的脂質(zhì)控制對患者病情的恢復(fù)仍是有益的；而在中醫(yī)“治未病”方面，化痰可能比化瘀更值得大家關(guān)注。但由于本研究納入的病例較少，因此，確切的結(jié)論有待進一步深入研究加以證實。