張惠娜，谷 巍，王 菲

糖尿病腎病是常見的一種糖尿病并發(fā)癥，隨著疾病進(jìn)展糖尿病腎病逐步發(fā)展為慢性腎衰竭，最終導(dǎo)致患者死亡。體內(nèi)持續(xù)高糖可促使腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并可進(jìn)一步誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加重腎小管上皮細(xì)胞損傷，而腎小管上皮細(xì)胞損傷是引起糖尿病腎病的重要病理基礎(chǔ)[1]。中藥具有毒副作用小且效果好等優(yōu)點，在抗炎、抗細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用，研究表明部分中藥可通過減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷，減緩糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程[2-4]。麝香酮屬于一種中藥活性單體，可緩解心肌缺血癥狀，研究表明其可通過抑制多柔比星誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞損傷[5]。miR-191在腎臟缺血再灌注損傷細(xì)胞中表達(dá)升高，并可通過促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腎臟缺血再灌注損傷[6]。但麝香酮和miR-191對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響尚未可知。因此，本研究旨在探討麝香酮是否通過調(diào)控miR-191的表達(dá)進(jìn)而影響高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 麝香酮購自上海同田生物技術(shù)有限公司(批號：541-91-3，純度≥98%)；人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自上海奧陸生物科技有限公司；凋亡檢測試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；miRNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR試劑購自美國Thermo Fisher公司；anti-miR-191、anti-miR-NC、miR-191 mimics、miR-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗人Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9抗體購自美國CST公司。

1.2研究方法

1.2.1高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)[7]：HK-2細(xì)胞置于DMEM完全培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞(3×104個/ml)接種于6孔板(100 μl/孔)，用含30 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為高糖組(HG組)；用含5.5 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為正常對照組(Con組)。

1.2.2實驗處理及分組：HK-2細(xì)胞(1×104個/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，用含不同濃度(5、10、20 μmol/L)麝香酮[8]與30 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將anti-miR-NC、anti-miR-191分別轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，加入含30 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，分別記為HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-191組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC、miR-191 mimics分別轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，加入含20 μmol/L麝香酮與30 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，分別記為HG+麝香酮+miR-NC組、HG+麝香酮+miR-191組。

1.2.3ELISA法檢測IL-6、TNF-α水平：收集各組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α水平，按照試劑盒說明書操作，在反應(yīng)孔內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μl，在空白對照孔內(nèi)加入稀釋液100 μl，待空白對照孔細(xì)胞調(diào)零后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計算IL-6、TNF-α水平。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：取各組HK-2細(xì)胞經(jīng)1000 r/min離心6 min后棄上清，加入預(yù)冷PBS液洗滌細(xì)胞后再加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞500 μl，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作并應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-191表達(dá)：用miRNA提取試劑盒分別提取各組HK-2細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 2 μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用2-ΔΔCt法計算miR-191相對表達(dá)量。

1.2.6Western blot法檢測Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)：收集各組HK-2細(xì)胞加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，按照每孔30 μg蛋白樣品上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳條件：80 V 30 min，120 V 90 min，根據(jù)marker位置切膠并應(yīng)用濕轉(zhuǎn)膜儀將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，分別加入Cleaved-caspase3(1︰1000)、Cleaved-caspase9(1︰1000)一抗與內(nèi)參GAPDH抗體(1︰3000)稀釋液4℃孵育過夜，加入二抗稀釋液(1︰5000)室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光試劑顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1麝香酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響 與Con組比較，HG組IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與HG組比較，HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，且隨著麝香酮處理劑量的增加IL-6、TNF-α水平逐漸降低(P<0.05)。見表1。

表1 麝香酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

2.2麝香酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，HG組Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平升高(P<0.05)；與HG組比較，HG+低劑量組、HG+中劑量組及HG+高劑量組Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平降低(P<0.05)，且隨麝香酮處理劑量的增加Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平逐漸降低(P<0.05)。見圖1和表2。Con組、HG組、HG+低劑量組、HG+中劑量組及HG+高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為(5.77±0.56)%、(31.65±3.11)%、(23.86±2.09)%、(17.05±1.31)%、(9.43±0.81)%。與Con組比較，HG組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與HG組比較，HG+低劑量組、HG+中劑量組及HG+高劑量組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，且隨麝香酮處理濃度的增加細(xì)胞凋亡率逐漸降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 麝香酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Con組予5.5 mmol/L葡萄糖溶液培養(yǎng)24 h，HG組予30 mmol/L葡萄糖溶液培養(yǎng)24 h，HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組分別予30 mmol/L葡萄糖溶液+5、10、20 μmol/L麝香酮培養(yǎng)24 h

圖2 麝香酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡流式圖Con組予5.5 mmol/L葡萄糖溶液培養(yǎng)24 h，HG組予30 mmol/L葡萄糖溶液培養(yǎng)24 h，HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組分別予30 mmol/L葡萄糖溶液+5、10、20 μmol/L麝香酮培養(yǎng)24 h

表2 各組腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.3麝香酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞miR-191表達(dá)的影響 Con組、HG組、HG+低劑量組、HG+中劑量組及HG+高劑量組miR-191表達(dá)量分別為1.00±0.00、3.58±0.22、2.81±0.21、1.97±0.17、1.36±0.12。與Con組比較，HG組miR-191表達(dá)量升高(P<0.05)；與HG組比較，HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組miR-191表達(dá)量降低(P<0.05)，且隨麝香酮處理濃度的增加miR-191表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)。

2.4干擾miR-191表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響 與HG+anti-miR-NC組比較，HG+anti-miR-191組IL-6水平、TNF-α水平、細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平均降低(P<0.05)，見圖3、表3。

表3 干擾miR-191表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響

圖3 干擾miR-191表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響A.凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B.細(xì)胞凋亡流式圖

2.5過表達(dá)miR-191逆轉(zhuǎn)麝香酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的作用 與HG+麝香酮+miR-NC組比較，HG+麝香酮+miR-191組IL-6水平、TNF-α水平、細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平均升高(P<0.05)。見圖4、表4。

表4 過表達(dá)miR-191逆轉(zhuǎn)麝香酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的作用

圖4 過表達(dá)miR-191逆轉(zhuǎn)麝香酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用A.凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B.細(xì)胞凋亡流式圖

3 討論

高血糖可引起線粒體功能障礙從而促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生，由于活性氧、促炎因子的大量生成導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷，因而減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷成為治療糖尿病腎病的關(guān)鍵。高糖環(huán)境下可促使活性氧等過多生成造成核酸斷裂、酶失活等破壞性過程，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，文獻(xiàn)報道部分中藥可通過抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞損傷[9]。miRNA在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中異常表達(dá)，并可通過調(diào)控靶基因表達(dá)而參與腎小管上皮細(xì)胞損傷過程[10]。已有研究發(fā)現(xiàn),部分中藥可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)減緩糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程[11]。

中藥麝香具有鎮(zhèn)心安神等功效，麝香酮是麝香的主要活性成分，研究表明麝香酮具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，可減輕模型大鼠早期創(chuàng)傷性腦損傷并改善其神經(jīng)功能[12-13]。麝香酮還可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α水平升高，與文獻(xiàn)[15]報道結(jié)果相似，提示成功構(gòu)建了高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷模型；且麝香酮還以濃度依賴性的方式降低高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α水平。本研究結(jié)果還顯示，高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平升高，與既往研究[16]結(jié)果相似;且隨麝香酮處理濃度的增加，高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平逐漸降低，提示麝香酮可能通過抑制高糖狀態(tài)誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡、減輕細(xì)胞炎癥損傷的目的。

本研究結(jié)果還顯示，高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中miR-191表達(dá)量升高，且麝香酮以濃度依賴性的方式降低miR-191表達(dá)量，提示麝香酮可能通過抑制miR-191表達(dá)而發(fā)揮作用。研究表明，miR-191在急性缺血性腦卒中患者中表達(dá)升高，miR-191過表達(dá)可促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[17]。miR-191在異氟烷誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷小鼠模型海馬組織中表達(dá)上調(diào)，表達(dá)下調(diào)可減輕其神經(jīng)損傷程度[18]。miR-191在肝缺血再灌注損傷和缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷小鼠模型肝組織中表達(dá)上調(diào)，干擾其表達(dá)可抑制模型小鼠肝損傷進(jìn)程[19]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-191表達(dá)可以拮抗麝香酮對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的炎癥損傷及凋亡作用，提示麝香酮可能通過調(diào)控miR-191表達(dá)，從而減緩糖尿病腎病的進(jìn)程。

綜上，麝香酮通過抑制miR-191表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的炎癥損傷及細(xì)胞凋亡，達(dá)到減輕細(xì)胞炎癥損傷的目的，可為麝香酮治療糖尿病腎病提供理論基礎(chǔ)，還可為糖尿病腎病治療藥物的研發(fā)提供新的方向。