張佳慧，馬紅云，秦 娟

(江蘇省如皋市人民醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇 如皋 226500)

妊娠期高血壓屬于一種妊娠期特有的疾病，此病的臨床癥狀多表現(xiàn)為在妊娠20周之后患者出現(xiàn)蛋白尿、高血壓、水腫等，且嚴(yán)重的威脅著母嬰生命安全[1]。目前隨著臨床上對(duì)妊娠期高血壓的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，在此病的發(fā)生過程中胎盤功能障礙發(fā)揮著重要的作用，在整個(gè)妊娠過程中，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡情況不僅會(huì)影響胎盤的生理功能，還在一定程度上影響著整個(gè)妊娠過程中母嬰安全和妊娠結(jié)局[2]。目前臨床上對(duì)于妊娠期高血壓的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但部分研究認(rèn)為，此病的發(fā)生與微小RNA相關(guān)，微小RNA為內(nèi)源性單鏈小RNA，其經(jīng)多種途徑參與妊娠期高血壓的發(fā)生[3]?；谏鲜鲅芯勘尘埃F(xiàn)分析沉默微小RNA-26b(Micro RNA-26b，miR-26b)對(duì)妊娠期高血壓胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/Akt通路的影響，旨在為臨床上妊娠期高血壓的研究提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料 研究細(xì)胞：人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SV-neo購自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院臨床基礎(chǔ)研究所。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑：N-硝基-L-精氨酸甲酯(Sigma公司)；miR-26b過表達(dá)質(zhì)粒、miR-26b沉默質(zhì)粒構(gòu)建(上海吉瑪公司)；Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠PI3K抗體、兔抗大鼠p-PI3K抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)；兔抗人Akt抗體、兔抗人p-Akt抗體(深圳欣博盛生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠Bcl-2抗體、兔抗大鼠Bax抗體(武漢益普生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建使用N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞模擬妊娠期高血壓微環(huán)境，將所購買的人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SV-neo放置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在溫度為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞密度在80%左右時(shí)，使用100 μmol/L的N-硝基-L-精氨酸甲酯進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，做后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 查找miR-26b序列，構(gòu)建miR-26b過表達(dá)質(zhì)粒、miR-26b沉默質(zhì)粒，由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成，miR-26b過表達(dá)質(zhì)粒引物：5′-UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3′，miR-26b沉默質(zhì)粒引物：5′-ACCUAUCCUGAAUUACU-UGAA-3′。將所培養(yǎng)的細(xì)胞分為3組，即為N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞后不做任何處理的空白組、N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞后做miR-26b過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的過表達(dá)組、N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞后做miR-26b沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的沉默組，將所構(gòu)建的miR-26b過表達(dá)質(zhì)粒、miR-26b沉默質(zhì)粒采用Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染至過表達(dá)組、沉默組細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后觀察細(xì)胞變化。

1.2.3細(xì)胞增殖的檢測(cè) 使用MTT比色法測(cè)定，將所測(cè)定的細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整濃度為3×104個(gè)/mL，上述操作完成后將所測(cè)定的細(xì)胞在96孔板中接種，每孔中加入200 μL的細(xì)胞懸液培養(yǎng)24、48、72 h后(培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2)將10 μL MTT試劑加入，孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，計(jì)算增殖率。細(xì)胞增殖率=(檢測(cè)的細(xì)胞組OD值/空白組OD值)×100%。重復(fù)測(cè)量5次，取均值。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 使用TUNEL法測(cè)定，將所培養(yǎng)的細(xì)胞做洗滌、DAPI染色封片后的細(xì)胞核分別呈現(xiàn)為藍(lán)色熒光、綠色熒光，其中藍(lán)色熒光表示陰性細(xì)胞數(shù)，綠色熒光表示陽性細(xì)胞數(shù)，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。重復(fù)測(cè)量5次，取均值。

1.2.5細(xì)胞PI3K/Akt通路蛋白檢測(cè)細(xì)胞磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況使用Western Blot法測(cè)定，對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞做離心、蛋白提取，提取完成后使用BCA做蛋白定量測(cè)定，將所提取的50 μg蛋白加入至2×SDS凝膠緩沖液中，做電泳、轉(zhuǎn)膜、取膜、固定、封閉處理，將1∶1 000比例的TBST稀釋的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax一抗，在溫度為4 ℃的環(huán)境下孵育過夜，TBST重復(fù)做3次洗膜處理，加入1∶10 000 TBST稀釋的二抗，搖動(dòng)孵育60 min，TBST重復(fù)做3次洗膜處理，使用DAB做顯色處理，分析蛋白表達(dá)情況。以GAPDH蛋白為內(nèi)參。重復(fù)測(cè)量5次，取均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13組細(xì)胞miR-26b表達(dá)量比較 與空白組相比過表達(dá)組miR-26b表達(dá)量升高，沉默組miR-26b表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明miR-26b轉(zhuǎn)染成功。見表1。

表1 3組細(xì)胞miR-26b表達(dá)量比較Table 1 Comparison of miR-26b expression in three groups

2.23組細(xì)胞增殖情況比較 過表達(dá)組24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖率逐漸降低，沉默組逐漸升高，3組在組間、時(shí)點(diǎn)間、組間·時(shí)點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組細(xì)胞增殖情況比較Table 2 Comparison of cell proliferation in three groups

2.33組細(xì)胞凋亡情況比較 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡所獲得的圖像顯示，空白組細(xì)胞核綠色熒光占比低于藍(lán)色熒光占比，有細(xì)胞碎片，細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象；過表達(dá)組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯升高，其細(xì)胞核多為綠色熒光，細(xì)胞核破裂，有細(xì)胞碎片；沉默組有少量細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核多為藍(lán)色熒光。見圖1。與空白組相比，過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率升高，沉默組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與過表達(dá)組相比，沉默組細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

圖1 細(xì)胞凋亡TUNEL圖(× 40)A.空白組；B.過表達(dá)組；C.沉默組Figure 1 TUNEL of apoptosis(× 40)

表3 3組細(xì)胞凋亡情況比較Table 3 Comparison of apoptosis in three groups

2.43組細(xì)胞PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)量比較 與空白組相比，過表達(dá)組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)量降低，Bax蛋白表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白組相比，沉默組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)量升高，Bax蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與過表達(dá)組相比，沉默組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)量升高，Bax蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 3組細(xì)胞PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)量比較Table 4 Comparison of PI3K/Akt pathway protein expression in cells among three groups

圖2 Western Blot法測(cè)定PI3K/Akt通路蛋白的Western blot圖Figure 2 Western Blot diagram of PI3K/Akt pathway protein detected by Western blot

3 討 論

妊娠期高血壓在妊娠期較為常見，目前對(duì)于此病的確切誘發(fā)機(jī)制尚不完全明確，但就目前研究來說，此病的發(fā)生與多種因素相關(guān)，包括血管內(nèi)皮損傷、機(jī)體免疫異常、胰島素抵抗、胎盤缺血、氧化應(yīng)激等[4-5]。有研究顯示，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡與胎盤形成、胚胎生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，在胚胎著床后來自于絨毛末端的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行增殖，其經(jīng)增殖作用所產(chǎn)生的滋養(yǎng)細(xì)胞在蛻膜基底層固定后侵入至蛻膜螺旋動(dòng)脈中，參與血管重塑的過程，最終建立起正常的子宮胎盤血供[6]。但在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)異常的增殖和凋亡時(shí)，會(huì)在一定程度上損傷正常的子宮胎盤血供，進(jìn)而作用于子宮胎盤循環(huán)、阻礙胎盤形成，最終導(dǎo)致妊娠期高血壓、胎兒生長(zhǎng)受限的發(fā)生[7-8]。綜合上述分析，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡與妊娠期高血壓密切相關(guān)，可能改善異常增殖、凋亡來改善妊娠期高血壓癥狀，本研究分析沉默miR-26b對(duì)妊娠期高血壓胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/Akt通路的影響，以改善胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡異常行為，修復(fù)損傷的胎盤組織。

微小RNA是近年來發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度大約為22nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于多種生物體中，經(jīng)過與靶mRNA的堿基產(chǎn)生特異性配對(duì)作用而發(fā)揮其降解靶mRNA、抑制翻譯的作用，經(jīng)上述作用后調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，參與機(jī)體一系列生理病理過程，包括細(xì)胞生物學(xué)行為(生長(zhǎng)、增殖、凋亡)、惡性腫瘤、炎癥性疾病、內(nèi)分泌疾病等[9-10]。miR-26b屬于微小RNA家族成員之一，其定位于CTDSP1基因的第4個(gè)內(nèi)含子區(qū)域，無獨(dú)立的啟動(dòng)子，其廣泛表達(dá)與腫瘤細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞等多種細(xì)胞中，目前已經(jīng)證實(shí)miR-26b參與惡性腫瘤發(fā)生、子癇前期的發(fā)生發(fā)展中[11-13]。冀琛[14]在其研究中發(fā)現(xiàn)，妊娠期高血壓疾病患者血清miR-26b表達(dá)量升高。魏娜等[15]均在其研究中發(fā)現(xiàn)，miR-26b在妊高癥患者胎盤中高表達(dá)?；诖?，本文研究了沉默miR-26b對(duì)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默miR-26b后發(fā)現(xiàn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡明顯被抑制，而增殖率明顯增加，此結(jié)果提示著，miR-26b可能經(jīng)誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、增殖異常發(fā)揮促進(jìn)妊娠期高血壓發(fā)生的作用，沉默其表達(dá)可改變上述異常情況，最終發(fā)揮其改善妊娠期高血壓癥狀的作用。

PI3K/Akt通路在臨床上被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的經(jīng)典信號(hào)通路之一，PI3K由一個(gè)催化亞單位p110和調(diào)節(jié)亞單位p85所組成的磷脂激酶，其具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性。Akt為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其與蛋白激酶C、蛋白激酶A具有較高的同源性，在臨床上被稱為蛋白激酶B[16-18]。PI3K是生長(zhǎng)因子所激活的RTKs和GPCRs重要的下游信號(hào)分子，當(dāng)其被活化后會(huì)激活A(yù)kt，促使磷酸化的Akt生成，而被活化的Akt經(jīng)一系列的級(jí)聯(lián)結(jié)果參與細(xì)胞增殖、凋亡過程[19-21]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)miR-26b沉默處理的細(xì)胞，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)量升高，Bax蛋白表達(dá)量降低，此結(jié)果提示著，miR-26b沉默可能經(jīng)激活PI3K/Akt通路發(fā)揮其抑制妊娠期高血壓胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)增殖的作用。

綜上所述，miR-26b沉默處理的妊娠期高血壓胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡明顯被抑制，增殖率增加，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt通路相關(guān)。