董麗珍，趙亞軍，李夢(mèng)檀，趙建華

（1.鄭州市第二人民醫(yī)檢驗(yàn)科；2.河南省疾病預(yù)防控制中心門診部；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

缺血性腦卒中是臨床常見的腦卒中類型，致殘率較高，其發(fā)病與遺傳因素、代謝因素、環(huán)境因素等均密切相關(guān)。近年來越來越多的臨床證據(jù)表明，高同型半胱氨酸（Hcy）血癥是多種心腦血管事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1,2]，而亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）在Hcy的代謝過程中有重要作用，其催化活性降低會(huì)影響Hcy 代謝并造成Hcy 含量升高?；蚨鄳B(tài)性是影響MTHFR 催化活性的重要機(jī)制，MTHFR基因在第677 位堿基發(fā)生C 向T的突變會(huì)使基因編碼產(chǎn)物的催化活性下降并影響Hcy代謝[3]。已有多項(xiàng)研究報(bào)道，心肌梗死患者、頸動(dòng)脈粥樣硬化患者、高Hcy 血癥患者體內(nèi)存在MTHFR基因C677T 位點(diǎn)的多態(tài)性[4,5]。為了明確MTHFR基因C677T 位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)系，本研究分析了缺血性腦卒中患者M(jìn)THFR基因C677T 位點(diǎn)多態(tài)性的變化及其與頸動(dòng)脈斑塊類型、神經(jīng)損傷的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年2 月-2018年12 月在我院診斷為缺血性腦卒中的患者作為卒中組，入組標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)頭顱MRI 檢查明確診斷為缺血性腦卒中；⑵臨床資料完整；⑶首次發(fā)病且于發(fā)病5日內(nèi)就診。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴既往有腦卒中、腦外傷病史；⑵正在服用葉酸、維生素B12 等影響Hcy 代謝藥物；⑶既往有惡性腫瘤、結(jié)締組織病、外科手術(shù)病史。另取同期體檢的健康志愿者作為對(duì)照組。卒中組共76例，包括男性46例、女性30例，年齡39～64 歲、平均51.23±8.32 歲；對(duì)照組共80例，包括男性58例、女性32例,年齡35～60 歲、平均49.58±9.12 歲。兩組間一般資料的比較無顯著性差異（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 MTHFR基因多態(tài)性的檢測(cè) 取肘靜脈血2mL，采用試劑盒提取基因組DNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，MTHFR基因的上游引物序列為5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’、下游引物序列為：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’,經(jīng)94℃30 s、62℃30s、72℃30s 反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)后 得到PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶Hinf I對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，取酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后在凝膠成像儀下觀察，產(chǎn)物大小198bp 為CC基因型、175bp 為TT基因型、198bp和175bp 為TC基因型（圖1）。

圖1 部分患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性的限制性片段長度分析

1.2.2 頸動(dòng)脈斑塊類型的檢測(cè) 卒中組患者采用彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行頸動(dòng)脈超聲檢查，探頭頻率5-15MHz，掃查頸總動(dòng)脈的分叉近2.0cm及頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈的分叉遠(yuǎn)1.0cm，測(cè)量內(nèi)中膜厚度、觀察斑塊特征，由2 名高年資超聲科醫(yī)生判斷斑塊性質(zhì)，包括扁平斑塊、軟斑塊、硬斑塊、潰瘍斑塊，其中軟斑塊和潰瘍斑塊屬于易損斑塊，扁平斑塊、硬斑塊屬于穩(wěn)定斑塊。

1.2.3 血清Hcy及神經(jīng)損傷標(biāo)志物的檢測(cè) 取肘靜脈血5ml，靜置后離心分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)Hcy、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、S100B的含量，操作過程均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料的兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料的三組間比較采用方差分析,卒中的危險(xiǎn)因素采用logistics 回歸分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卒中組和對(duì)照組MTHFR基因多態(tài)性的比較卒中組中基因型TT的構(gòu)成比及等位基因T的基因頻率明顯高于對(duì)照組（P>0.05），基因型CC的構(gòu)成比及等位基因C的基因頻率明顯低于對(duì)照組（P>0.05），基因型CT的構(gòu)成比與對(duì)照組比較無顯著性差異（P>0.05）。

表1 卒中組和對(duì)照組MTHFR基因多態(tài)性的比較

2.2 卒中組中不同MTHFR基因多態(tài)性患者Hcy、頸動(dòng)脈斑塊類型、神經(jīng)標(biāo)志物的比較 卒中組中MTHFR基因TT基因型患者的血清Hcy、NSE、S100B 含量及頸動(dòng)脈易損斑塊百分比明顯高于CT基因型、CC基因型患者（P<0.05），CT基因型患者的血清Hcy、NSE、S100B 含量及頸動(dòng)脈易損斑塊百分比與CC基因型患者比較無顯著性差異（P>0.05）。

表2 卒中組中不同MTHFR基因多態(tài)性患者Hcy、頸動(dòng)脈斑塊類型、神經(jīng)標(biāo)志物的比較

2.3 卒中危險(xiǎn)因素的logistics 回歸分析 以腦卒中為應(yīng)變量，MTHFR基因C677T 突變、Hcy 含量、頸動(dòng)脈斑塊類型為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistics 回歸分析可知，MTHFR基因C677T 純合突變、高Hcy 血癥、頸動(dòng)脈易損斑塊是腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。

表3 卒中危險(xiǎn)因素的logistics 回歸分析

3 討論

高Hcy 血癥是近年來備受關(guān)注的心腦血管疾病危險(xiǎn)因素，異常升高的Hcy 能夠通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)參與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展[6,7]。MTFFR 是Hcy 代謝過程中的關(guān)鍵酶，其活性下降會(huì)影響Hcy 代謝、增加Hcy 含量。關(guān)于MTFFR 活性調(diào)控機(jī)制的研究認(rèn)為，MTFFR基因的多態(tài)性會(huì)影響編碼產(chǎn)物的催化活性，其中第677 堿基C 向T突變的多態(tài)性已經(jīng)在心肌梗死、頸動(dòng)脈粥樣硬化患者中被證實(shí)，發(fā)生該突變后會(huì)使MTFFR的耐熱性和酶活性均減弱[8-10]。為了明確MTFFR基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)系，本研究首先對(duì)缺血性腦卒中患者M(jìn)TFFR基因C677T 位點(diǎn)的基因型構(gòu)成比和等位基因頻率進(jìn)行了分析。卒中組患者M(jìn)TFFR基因純合突變基因型TT的構(gòu)成比及突變基因T的基因頻率均明顯升高，說明MTFFR基因C677T 位點(diǎn)C 向T的突變與缺血性腦卒中的發(fā)生有關(guān)。

MTFFR基因發(fā)生C677T 位點(diǎn)C 向T的突變后，編碼產(chǎn)物催化Hcy 代謝的活性明顯減弱，本研究對(duì)Hcy 含量的分析顯示：卒中組中MTHFR基因TT基因型患者的血清Hcy 含量明顯高于CT基因型、CC基因型患者，而CT基因型與CC基因型患者之間Hcy 含量無明顯差異，說明MTFFR基因發(fā)生C677T 位點(diǎn)的純合突變后會(huì)影響Hcy 代謝、增加Hcy 含量，而雜合突變并不影響Hcy 代謝、Hcy含量為發(fā)生明顯變化。Hcy 具有促炎、促氧化的作用，通過刺激炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活來參與動(dòng)脈粥樣硬化形成、粥樣斑塊穩(wěn)定性下降等過程，進(jìn)而引起心肌梗死、腦卒中等疾病的發(fā)生[11,12]。頸動(dòng)脈是評(píng)價(jià)大動(dòng)脈粥樣硬化的窗口,頸動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化是腦卒中的危險(xiǎn)因素之一,而頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性的下降會(huì)直接增加斑塊脫落并形成腦血栓的風(fēng)險(xiǎn)[13,14]；NSE和S100B 是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)志物,能夠在腦卒中病程中用于評(píng)價(jià)神經(jīng)損傷的程度[15,16]。

本研究通過頸動(dòng)脈超聲來評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化的特征、通過血清NSE和S100B 含量的檢測(cè)來評(píng)價(jià)神經(jīng)損害的程度，卒中組中MTHFR基因TT基因型患者的血清NSE、S100B 含量及頸動(dòng)脈易損斑塊百分比明顯高于CT基因型、CC基因型患者，而CT基因型與CC基因型患者之間清NSE、S100B含量及頸動(dòng)脈易損斑塊百分比無明顯差異，說明MTFFR基因發(fā)生C677T 位點(diǎn)的純合突變后會(huì)加重神經(jīng)損害、影響斑塊穩(wěn)定性，而雜合突變不影響神經(jīng)損害程度和斑塊穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步進(jìn)行了logistics 回歸分析，旨在明確MTFFR基因多態(tài)性、Hcy 含量及頸動(dòng)脈斑塊類型在缺血性腦卒中發(fā)生和發(fā)展中的作用，結(jié)果顯示：MTHFR基因C677T 純合突變、高Hcy 血癥、頸動(dòng)脈易損斑塊是腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，缺血性腦卒中患者存在顯著的MTHFR基因多態(tài)性，表現(xiàn)為C677T 位點(diǎn)C 向T的突變；該多態(tài)性與缺血性腦卒中患者頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性下降、神經(jīng)損傷程度加重有關(guān)。