毛璞，顏樂(lè)平，單靖嵐，王亞，張容，葉丹

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，廣東 廣州 510120；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州510120）

ICU 病房患者病情重，侵入性操作多，是院內(nèi)感染控制的重點(diǎn)部門。醫(yī)療環(huán)境是院內(nèi)感染交叉?zhèn)鞑ズ土餍械闹饕搭^及介質(zhì)。本研究對(duì)醫(yī)院ICU病房環(huán)境及醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行微生物分布的隨訪監(jiān)測(cè)，研究其分布特征，為ICU 病房感染的預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)，指導(dǎo)醫(yī)院感染防控措施。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2019年3 月，對(duì)重癥監(jiān)護(hù)室的病房環(huán)境進(jìn)行采樣，樣本來(lái)源包括醫(yī)護(hù)人員手部、醫(yī)護(hù)人員鼻部、回風(fēng)口、物體表面（筆、病歷夾、電腦、屏幕、按鈕、鍵盤、床欄、治療車）、醫(yī)護(hù)人員工作服等。

1.2 采樣及檢測(cè)方法 根據(jù)WS/T367-2012 《醫(yī)療機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范》中的相關(guān)方法進(jìn)行采樣。將采集的棉試子放入洗脫液中充分振蕩后，加入肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌，37℃培養(yǎng)24h,接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中。挑取單菌落于血瓊脂平板上擴(kuò)大培養(yǎng)24h，用于脂肪酸的提取。

1.3 微生物鑒定 利用脂肪酸氣相色譜分析方法進(jìn)行微生物鑒定。首先，菌體脂肪酸甲酯的提?、旁砘喝∵m量（35～40mg）培養(yǎng)物于8ml 螺口玻璃管中，加入lml 皂化試劑（45g NaOH,150ml 甲醇,150ml ddH2O），擰緊螺蓋，100℃沸水浴5min，取出振蕩5～10s，再度擰緊螺蓋，繼續(xù)沸水浴25min。⑵甲基化：將樣品管冷至室溫后，加入2ml 甲基化試劑（325ml 6N 濃鹽酸，275ml 甲醇），擰緊螺蓋振蕩，于80±1℃水浴l0min，水浴冷卻。此步驟需嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間，以免羥基酸和環(huán)式脂肪酸受到破壞。⑶萃取：在冷卻的樣品管中加入1.5ml 萃取溶劑（200ml 己烷，200ml 甲基叔丁醚）混勻，快速振蕩l0min，棄去下層水相。⑷洗滌：在剩余有機(jī)相中加人3ml 溶液Ⅳ，快速振蕩5min 左右，取2／3上層有機(jī)相置氣相色譜樣品瓶中，擰緊瓶蓋備用上機(jī)。采用Agilent 7890A 氣相色譜儀進(jìn)行脂肪酸甲酯分析。MIDI Sherlock 系統(tǒng)根據(jù)各脂肪酸組分保留時(shí)間計(jì)算等鏈長(zhǎng)值,確定目標(biāo)組分的存在,采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，再將二者與系統(tǒng)譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)值匹配計(jì)算相似度(SI)，從而給出一種或幾種可能的菌種鑒定結(jié)果。在鑒定結(jié)果的判斷上，一般SI≥0.5 (腸桿菌科細(xì)菌需達(dá)0.7 以上)，且第一選擇和第二選擇的SI 差值大于0.100，則可以認(rèn)為鑒定成功。若SI 值在0.3-0.5 之間，且第一選擇和第二選擇的SI 差值大于0.100，則表明第一選擇與第二選擇分開(kāi)，鑒定可能成功，但第一選擇所列的菌種為非典型菌株。當(dāng)SI值小于0.300 時(shí)，則認(rèn)為該菌株不存在于數(shù)據(jù)庫(kù)中。一般以最高SI的菌種名稱作為鑒定結(jié)果，但當(dāng)報(bào)告的幾個(gè)菌種的SI 比較接近時(shí)，則根據(jù)色譜圖特征及菌落生長(zhǎng)特性進(jìn)行綜合判斷。

2 結(jié)果

2.1 微生物檢出情況 共采標(biāo)本229 個(gè)，分離51個(gè)菌株，陽(yáng)性率為22.27%（51/229）。見(jiàn)表1。

表1 ICU 病房微生物檢出情況

2.2 菌種分布情況 氣相色譜成功鑒定51 株，分離G＋球菌25 株，以微球菌為主（20/25）；G＋桿菌9株；G-桿菌17 株，肺炎克雷伯氏菌（6/12）和粘質(zhì)沙雷菌（5/12）占主要部分。

3 討論

重癥監(jiān)護(hù)室病房的患者由于免疫力低下、接受侵入性操作多，易出現(xiàn)細(xì)菌感染性疾病[1]。院內(nèi)感染最常見(jiàn)的致病菌，包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌和粘質(zhì)沙雷氏菌[2]。本次ICU 病房分離的常見(jiàn)病原菌中，肺炎克雷伯菌的檢出率最高（6/51），該菌對(duì)人致病性較強(qiáng)，易產(chǎn)生耐藥性[3]，是重要的條件致病菌。曾在美國(guó)引起院內(nèi)感染，并擴(kuò)散到不同地區(qū)[3]。本研究結(jié)果提醒謹(jǐn)防該菌在ICU 病房的流行。

研究發(fā)現(xiàn)醫(yī)護(hù)人員鼻部和回風(fēng)口培養(yǎng)的陽(yáng)性率最高。鼻腔是人體呼吸系統(tǒng)的首個(gè)門戶，對(duì)吸入的空氣起過(guò)濾作用。我院的結(jié)果顯示常見(jiàn)病原菌中以銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷菌定植于醫(yī)務(wù)人員的鼻腔。而以往研究報(bào)道金黃色葡萄球菌較多定植于鼻腔[4]。這可能與在西方國(guó)家金黃色葡萄球菌的流行及受重視程度高有關(guān)。

表2 ICU 病房菌種分布情況

空氣經(jīng)新風(fēng)口送入病房，然后經(jīng)回風(fēng)口回流。回風(fēng)口處截流部分病房空氣中的菌株，此處分離的菌株可以代表病房空氣中的菌株。微球菌在自然空氣中細(xì)菌分布比例最高，其中藤黃微球菌最為常見(jiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)回風(fēng)口處分離的G＋球菌以微球菌為主要，其中又以藤黃微球菌所占比較最高。此處分離的G-桿菌以肺炎克雷伯菌為主，且分離的菌種組成與醫(yī)護(hù)人員鼻腔分離的菌種組成相近，均以肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷菌和銅綠假單胞菌等常見(jiàn)院內(nèi)感染病原菌組成。鑒于回風(fēng)口屬于ICU通風(fēng)換氣系統(tǒng)，通風(fēng)口的環(huán)境易于病原微生物生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)易導(dǎo)致微生物的擴(kuò)散，加之近年來(lái)微球菌引起的臨床感染時(shí)有報(bào)道[5,6]，提示須加強(qiáng)回風(fēng)口的清潔管理。同時(shí)醫(yī)務(wù)人員的手、物體表面、工作服等樣本的陽(yáng)性率較低，表明手衛(wèi)生、病房?jī)?nèi)高頻率接觸的物體表面和儀器設(shè)備的日常清潔執(zhí)行效果好。

現(xiàn)行常用的微生物鑒定方法主要為微生物生化鑒定。本研究采用的是氣相色譜法，利用Sherlock 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)不同菌株的脂肪酸圖譜進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)鑒定微生物[7]。氣相色譜在分析大量樣品時(shí)具有全自動(dòng)、速度快、精度高、費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)[8]。細(xì)菌在第一步皂化過(guò)程即被殺滅，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程安全可靠。盡管該技術(shù)已應(yīng)用于同源性分析，如霍亂弧菌[9]，食品工業(yè)的污染菌沙門菌[10]等，但在常見(jiàn)病原菌的同源性分析上，與傳統(tǒng)脈沖場(chǎng)電泳分析結(jié)果的一致性較差[11,12]，因此在本研究中沒(méi)有進(jìn)行同源性的分析。