閆 華，邢 源，葉雨萌，郝延輝，喻 超，賈兆乾，左紅艷，李 楊

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心，北京 100048；3.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北省神經(jīng)藥理學(xué)重點實驗室，河北 張家口 075000）

小腸是人體內(nèi)對電離輻射最敏感的器官之一［1-2］。電離輻射可通過破壞小腸上皮黏膜的隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)，影響小腸上皮黏膜的吸收及屏障功能，引發(fā)放射性腸損傷（radiation induced intestinal injury，RⅢ）［3-5］。RⅢ的發(fā)生發(fā)展是全身放射性損傷死亡和救治失敗的關(guān)鍵原因，腸損傷及其導(dǎo)致的水電解質(zhì)紊亂、酸堿失衡和嚴(yán)重的腸源性感染等均為急性放射性損傷的主要死亡原因［3，6-8］。腹部和骨盆腫瘤患者接受局部放射治療后，通常會引發(fā)RⅢ，＞15%的患者會形成慢性腸損傷，這不僅明顯影響患者的生活質(zhì)量，同時限制腫瘤放療的劑量，一定程度上影響腫瘤的治療效果［3，9-10］。但目前其損傷機制尚未闡明，缺少有效的診斷及防治措施。因此，亟需進(jìn)一步探究其發(fā)病機制，尋找更為有效的RⅢ敏感生物標(biāo)志物和防治靶點。

ADP核糖基化因子樣6相互作用蛋白1（ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein 1，ARL6IP1）位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜，對于維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要［11-13］。研究發(fā)現(xiàn)，Arl6ip1基因與腫瘤細(xì)胞耐藥性相關(guān)，具有抗凋亡特性，參與腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲等過程［14］。Arl6ip1基因還參與興奮性突觸中的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的調(diào)節(jié)，沉默其表達(dá)可引發(fā)功能障礙［15］。有報道認(rèn)為，遺傳性痙攣性截癱和多發(fā)性感覺運動神經(jīng)疾病等患者體內(nèi)存在Arl6ip1基因突變體［16-17］。

本課題組前期制備了小鼠RⅢ模型，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究細(xì)胞放射敏感性并篩選與放射敏感性相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)腸道主要類型細(xì)胞如小腸干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等不同亞群細(xì)胞輻射敏感性存在較大差異。通過對照射后腸道主要細(xì)胞類型的存活細(xì)胞基因表達(dá)特征進(jìn)行分析，顯示Arl6ip1基因表達(dá)出現(xiàn)特異性增高。為驗證Arl6ip1基因在放射性損傷中的作用，本研究首先觀察放射性腸損傷模型小鼠空腸組織ARL6IP1蛋白表達(dá)的變化；隨后設(shè)計小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），構(gòu)建Arl6ip1敲低的小腸上皮細(xì)胞IEC-6，觀察ARL6IP1低表達(dá)對放射致DNA損傷和細(xì)胞存活率的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞、主要試劑和儀器

50只雄性SPF級C57BL/6N小鼠，體重20～25 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2016-0001，動物飼養(yǎng)在軍事醫(yī)學(xué)研究院動物房（溫度21～23℃，濕度40%～60%）。IEC-6細(xì)胞，廣州吉妮歐生物科技公司。為防止脫靶，根據(jù)Arl6ip1基因序列，設(shè)計3條序列不同的siRNA（表1）作用于Arl6ip1基因mRNA的不同位點，并合成雙鏈陰性對照siRNA（negative control siRNA，siRNA-NC），siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，分別插入慢病毒載體LV5（EF-1aF/GFP&Puro）中。小鼠抗人磷酸化組蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX，γH2AX）單抗、兔抗小鼠GAPDH單抗和兔抗人ARL6IP1單抗（一抗）及Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗），美國Abcam公司；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（二抗），中山金橋公司；胎牛血清和DMEM液體培養(yǎng)基，美國Gibco公司；青霉素和鏈霉素溶液，美國HyClone公司；0.25% EDTA-胰蛋白酶，美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶公司；CCK-8試劑盒，美國Bimake公司。

Tab.1 Small interfering RNA（siRNA）sequences targeting ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein 1（Arl6ip1）

60Co源，軍事醫(yī)學(xué)研究院；37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；超凈工作臺，南通滬南科學(xué)儀器公司；蛋白電泳儀，北京六一儀器廠；臺式高速離心機，上海醫(yī)學(xué)分析儀器廠；FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司；多功能酶標(biāo)儀（Victor-X3）和PE Time-lapse轉(zhuǎn)盤共聚焦活細(xì)胞成像系統(tǒng)，美國PerkinElmer公司。

1.2 小鼠急性RⅢ模型的制備

將C57BL/6N小鼠隨機分為正常對照組（10只）和照射組（40只），照射組采用60Co源γ射線進(jìn)行照射。小鼠稱重后ip給予0.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉。麻醉后固定于自制木板上，暴露腹部（上至劍突，下至恥骨聯(lián)合），用鉛磚將其余部位屏蔽，進(jìn)行全腹部單次照射：靶距為3 m，劑量15 Gy，劑量率123.69 cGy·min-1；正常對照組進(jìn)行假照射（將小鼠進(jìn)行麻醉固定，但未照射）。照射后，每天觀察小鼠的飲食、精神及活動狀態(tài)及有無腹瀉和血便等，記錄體重和存活數(shù)。

1.3 Western印跡法檢測小鼠空腸組織ARL6lP1蛋白表達(dá)

分別于照射后1，3，7和14 d取5只小鼠處死，從腹腔中取出整段小腸，去除內(nèi)容物后用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后稱量。從小鼠幽門開始截去5 cm，之后取空腸10 cm稱重，剪碎后按1∶10（體積比）加入RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑），并用超聲儀將組織震碎，離心后取上清液。加入等體積上樣緩沖液，置沸水浴中變性10 min。用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，取適量變性蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。蛋白分離結(jié)束后，采用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，將帶有蛋白樣品的聚偏氟乙烯（PVDF）膜浸入封閉液（5%脫脂奶粉）處理1～2 h。用封閉液洗膜后加入特異性一抗（1∶1000）4℃孵育24 h。再以封閉液洗膜后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶10000）于37℃反應(yīng)1 h。以二氨聯(lián)苯胺顯影后凝膠成像系統(tǒng)拍照，以GAPDH作內(nèi)參，分析蛋白條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA）值。ARL6IP1蛋白相對表達(dá)水平以IAARL6IP1/IAGAPDH比值表示。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及Arl6ip1敲低作用的驗證

將IEC-6細(xì)胞從液氮中取出后迅速置37℃水浴中解凍，并用移液器將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入離心管中。離心洗凈凍存液后，采用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將IEC-6細(xì)胞（1×105L-1）以每孔500 μL接種于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)約70%，棄培養(yǎng)基，將siRNA-NC，Arl6ip1-siRNA-132，Arl6ip1-siRNA-249和 Arl6ip1-siRNA-565慢病毒30 μL 加入270 μL培養(yǎng)基中，充分混勻后加入相應(yīng)孔中，每組6復(fù)孔。將24孔板置37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染24 h。棄含有siRNA慢病毒的培養(yǎng)基，加入500 μL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。慢病毒轉(zhuǎn)染后72 h，棄培養(yǎng)基，加入胰酶消化細(xì)胞，用PBS溶液洗滌后重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)。GFP陽性細(xì)胞為成功轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率（%）=GFP陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

慢病毒轉(zhuǎn)染后72 h，棄培養(yǎng)基，用生理鹽水洗滌1次，每孔加入100 μL RIPA細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至離心管中，置于冰上裂解15 min。離心后取上清液，用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，用Western印跡法驗證siRNA-NC和3條Arl6ip1-siRNA特異性敲低ARL6IP1效果。

1.5 細(xì)胞和照射

將IEC-6細(xì)胞隨機分為4組：即細(xì)胞對照組、細(xì)胞照射組、siRNA-NC轉(zhuǎn)染照射組和Arl6ip1-siRNA-565轉(zhuǎn)染照射組，每組6復(fù)孔，每孔加IEC-6 500 μL（1×105L-1）。Arl6ip1-siRNA-565和siRNA-NC慢病毒轉(zhuǎn)染IEC-6細(xì)胞后72 h，將細(xì)胞照射組、siRNA-NC轉(zhuǎn)染照射組和Arl6ip1-siRNA-565轉(zhuǎn)染照射組置60Co源照射臺進(jìn)行γ射線照射：靶距為4 m，劑量15 Gy，劑量率68.34 cGy·min-1。細(xì)胞對照組進(jìn)行假照射（將細(xì)胞24孔板帶至照射室，但未照射）。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

在照射后24和48 h，各組每孔加入10 μL CCK-8工作液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測吸光度值（A450nm）。細(xì)胞存活率（%）=〔實驗孔A450nm-空白孔A450nm〕/〔細(xì)胞對照孔A450nm-空白孔A450nm〕×100%?？瞻卓缀囵B(yǎng)基和CCK-8溶液，無細(xì)胞。

1.7 免疫熒光法檢測細(xì)胞中 γH2AX表達(dá)水平

將IEC-6細(xì)胞（1×105L-1）500 μL接種于玻片上，同1.6照射后3 h，各組加入適量4%多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定。室溫孵育15 min后撈片，用PBS洗滌2次。將0.3% Triton X-100滴加玻片上，室溫孵育10 min，PBS洗滌2次；以PBS稀釋小鼠抗人γH2AX單抗（一抗，1∶200）滴加于玻片上，4℃孵育過夜，用PBS洗滌2次；滴加Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗，1∶2000），37℃避光孵育1 h，用封片劑（含DAPI）封片，并在熒光顯微鏡下觀察。紅色熒光表示γH2AX表達(dá)陽性，熒光強度表示γH2AX的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠照射后一般狀態(tài)和存活數(shù)

小鼠腹部照射后1 d，體重和狀態(tài)較照射前無明顯變化；照射后2 d，開始出現(xiàn)進(jìn)食不佳，輕微腹瀉，體重減輕；照射后3 d，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、懶動、蜷縮成團，皮毛黯淡無光且脫毛，嚴(yán)重腹瀉，甚至個別小鼠出現(xiàn)血便，體重減輕；照射后7 d，小鼠活動緩慢，持續(xù)腹瀉，體重持續(xù)減輕；照射后14 d，小鼠狀態(tài)恢復(fù)良好，皮毛光滑，體重逐步恢復(fù)。

照射組小鼠自照射后2 d開始出現(xiàn)死亡，死亡1只；照射后3～5 d為死亡高峰期，死亡7只；照射后14 d，共死亡8只，死亡率為20%。正常對照組無死亡。

2.2 小鼠照射后空腸組織ARL6lP1蛋白表達(dá)

與正常對照組相比，小鼠照射后1和3 d，照射組空腸組織中ARL6IP1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；照射后7和14 d，照射組空腸組織中ARL6Ip1蛋白表達(dá)與正常對照組無顯著差異（圖1）。

Fig.1 Effect of radiation on expression of ARL6lP1 in jejunum of mice by Western blotting.The mice were exposed to 15 Gy of abdominal radiation.IA：integrated absorbance；B was the semi-quantitative result of A.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 Arl6ip1-siRNA轉(zhuǎn)染效率及Arl6ip1-siRNA轉(zhuǎn)染對lEC-6細(xì)胞ARL6lP1表達(dá)水平的影響

siRNA轉(zhuǎn)染IEC-6細(xì)胞后72 h，用流式細(xì)胞儀分析siRNA-NC，Arl6ip1-siRNA-132，Arl6ip1-siRNA-249和Arl6ip1-siRNA-565的轉(zhuǎn)染效率，分別為（89±4）%，（64±9）%，（45±7）%和（88±10）%（n=5）（圖2）。轉(zhuǎn)染Arl6ip1-siRNA-565后，IEC-6細(xì)胞中ARL6IP1蛋白表達(dá)水平較siRNA-NC組明顯降低（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染Arl6ip1-siRNA-132和Arl6ip1-siRNA-249后，IEC-6細(xì)胞中ARL6IP1蛋白表達(dá)水平與siRNA-NC組無顯著差異（圖3）。

2.4 敲低Arl6ip1對照射后lEC-6細(xì)胞存活率的影響

圖4結(jié)果表明，照射后24 h，與細(xì)胞對照組相比，細(xì)胞照射組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與細(xì)胞照射組相比，siRNA-NC轉(zhuǎn)染照射組細(xì)胞存活率無顯著變化，Arl6ip1-siRNA-565轉(zhuǎn)染照射組顯著降低（P＜0.05）；與siRNA-NC轉(zhuǎn)染照射組相比，Arl6ip1-siRNA-565轉(zhuǎn)染照射組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）。照射后48 h，各組細(xì)胞存活率變化與照射后24 h基本一致。

2.5 敲低Arl6ip1對照射后lEC-6細(xì)胞 γH2AX表達(dá)的影響

圖5結(jié)果表明，用Arl6ip1-siRNA-565和siRNA-NC慢病毒轉(zhuǎn)染IEC-6細(xì)胞后4 d，進(jìn)行60Co源γ射線照射3 h。免疫熒光法檢測結(jié)果表明，細(xì)胞對照組可見少量γH2AX陽性細(xì)胞，而細(xì)胞照射組和siRNA-NC轉(zhuǎn)染照射組可見較多散在的γH2AX陽性細(xì)胞，Arl6ip1-siRNA-565轉(zhuǎn)染照射組可見較為密集的γH2AX陽性細(xì)胞。經(jīng)過圖像分析，與細(xì)胞對照組相比，細(xì)胞照射組γH2AX熒光強度顯著升高（P＜0.05）；與細(xì)胞照射組相比，siRNA-NC轉(zhuǎn)染照射組γH2AX熒光強度無顯著差異，而Arl6ip1-siRNA-565轉(zhuǎn)染照射組γH2AX熒光強度顯著升高（P＜0.05）。與siRNA-NC轉(zhuǎn)染照射組相比，Arl6ip1-siRNA-565轉(zhuǎn)染照射組γH2AX熒光強度顯著升高（P＜0.05）。

Fig.2 lnfection efficiency of different siRNA-LV5（EF-1aF/GFP&Puro）assayed by flow cytometry.IEC-6 cells were infected with siRNA-NC，Arl6ip1-siRNA-132，Arl6ip1-siRNA-249 or Arl6ip1-siRNA-565 lentivirus for 3 d.The infection efficiency was detected with flow cytometry by calculating the percentage of green fluorescent protein（GFP）positive cells.B was the quantitative result of A.±s，n=6.

Fig.3 Protein expression of ARL6lP1 in Arl6ip1 knockout lEC-6 cells assayed by Western blotting.See Fig.2 for the cell transfection.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with siRNA-NC group.

Fig.4 Effect of Arl6ip1 knockdown on survival rate of lEC-6 cells after radiation assayed by cell counting Kit 8.See Fig.2 for the cell transfection.IEC-6 cells were exposed to 15 Gy of radiation.Cell survival rate（%）=［A450 nmof the test well-A450 nmof the blank well］/［A450 nmof the cell control well-A450 nmof the blank well］.±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with cell radiation group；△△P＜0.01，compared with siRNA-NC+ratiation group.

Fig.5 Effect of Arl6ip1 knockdown on expression of phosphorylated histone H2AX（ γH2AX）in lEC-6 cells after radiation assayed by immunofluorescence.See Fig.2 for the cell transfection and Fig.4 for the cell radiation.DNA damage was measured by the fluorescence intensity of γH2AX-positive cells 3 h post radiation.B was the quantitative result of A.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with cell radiation group；△P＜0.05，compared with siRNA-NC+radiation group.

3 討論

RⅢ主要包括小腸上皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)2個過程［3-4］，其中小腸上皮細(xì)胞損傷和修復(fù)受多種因素影響，如腸道免疫應(yīng)答［7］、P53通路調(diào)控［18］和局部循環(huán)系統(tǒng)改變［19］等。前期單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小腸上皮細(xì)胞損傷和修復(fù)在RⅢ中具有重要作用，其中Arl6ip1基因在小腸上皮細(xì)胞存在表達(dá)，且在照射后存活細(xì)胞中特異性高表達(dá)。本研究制備小鼠RⅢ模型，初步探索ARL6IP1蛋白在RⅢ前后表達(dá)水平的變化規(guī)律，并利用siRNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建Arl6ip1基因敲低的IEC-6細(xì)胞，通過觀察Arl6ip1基因敲低對電離輻射致細(xì)胞DNA損傷和存活的影響，探索Arl6ip1基因在電離輻射致細(xì)胞損傷過程中的作用。

動物實驗結(jié)果表明，在小鼠RⅢ模型中，照射后1和3 d，空腸組織中ARL6IP1蛋白表達(dá)顯著下降。本課題組單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，Arl6ip1基因在小腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)，結(jié)合既往研究結(jié)果，照射后3 d小腸上皮細(xì)胞凋亡和壞死，存活細(xì)胞減少［3］。由此推測，可能是由于RⅢ導(dǎo)致小腸上皮存活細(xì)胞數(shù)量下降，導(dǎo)致小腸組織中ARL6IP1表達(dá)下調(diào)。在照射后7和14 d，損傷的腸道黏膜逐漸修復(fù)，腸上皮存活細(xì)胞數(shù)增多，從而使腸道ARL6IP1蛋白表達(dá)逐步回升。上述結(jié)果表明，在RⅢ早期，腸上皮存活細(xì)胞中ARL6IP1表達(dá)雖然上調(diào)，但小腸組織中ARL6IP1表達(dá)下調(diào)。

細(xì)胞實驗結(jié)果表明，與細(xì)胞照射組和siRNA-NC轉(zhuǎn)染照射組相比，Arl6ip1-siRNA-565轉(zhuǎn)染照射組中γ-H2AX表達(dá)顯著上升，細(xì)胞存活率顯著下降，表明照射可引發(fā)IEC-6細(xì)胞DNA損傷，而敲低Arl6ip1可進(jìn)一步促進(jìn)照射對IEC-6細(xì)胞DNA損傷。此外，照射能抑制IEC-6細(xì)胞存活，Arl6ip1敲低能進(jìn)一步促進(jìn)照射對細(xì)胞存活的抑制作用。上述結(jié)果提示，Arl6ip1低表達(dá)可促進(jìn)照射后細(xì)胞DNA損傷，抑制細(xì)胞存活，從而加重電離輻射所致小腸上皮細(xì)胞損傷，提示ARL6IP1在RⅢ中可發(fā)揮抗DNA損傷活性。

電離輻射可直接作用于機體內(nèi)的生物大分子，引起大分子結(jié)構(gòu)的改變，或通過引發(fā)機體內(nèi)生物分子或水分子的電離或激發(fā)，產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致DNA等生物大分子的損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［20-23］。本研究結(jié)果表明，Arl6ip1下調(diào)可促進(jìn)電離輻射引發(fā)的DNA損傷及細(xì)胞凋亡，提示通過調(diào)控Arl6ip1的表達(dá)，可減輕RⅢ早期腸道上皮細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡，從而減輕腸道損傷，促進(jìn)RⅢ的恢復(fù)，該結(jié)果待后續(xù)采用動物實驗進(jìn)一步驗證。本研究為RⅢ機制和防治靶點研究提供了新思路，對于探索Arl6ip1基因在RⅢ發(fā)生中的抗損傷機制研究具有重要意義。