王舒哲，許波華，王 雁，黃芳華，邱云良

（1.上海工程技術(shù)大學化學化工學院，上海 201620；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203；3.益諾思生物技術(shù)南通有限公司，江蘇 南通 226133；4.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022）

細胞治療是指利用患者自體（或異體）的成體細胞或干細胞對組織、器官進行修復的治療方法，主要用于惡性腫瘤、骨髓移植、晚期股骨頭壞死、心肌梗死和腦損傷等疾病的臨床研究和治療。目前臨床試驗中使用的主要是間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）、T淋巴細胞、自然殺傷細胞（natural killer cells，NK）和造血干細胞，對樹突細胞（dendritic cells，DC）、巨噬細胞、肝細胞和上皮細胞以及其他細胞的研究較少［1-2］。2009年12月，美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準人異體骨髓MSC產(chǎn)品（Prochymal）上市，這是世界上第1個干細胞產(chǎn)品。隨后，澳大利亞、加拿大、韓國、意大利、新西蘭和日本等陸續(xù)批準干細胞產(chǎn)品上市或應(yīng)用。2017年下半年，美國FDA批準了2個嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）產(chǎn)品Kymriah和Yescarta上市。2020年7月，美國FDA再次批準了一項新的CAR-T細胞療法產(chǎn)品Tecartus，這是美國FDA批準的首個基于細胞的基因療法［3］。

細胞療法作為腫瘤學研究和臨床實踐中的新型療法，受到相當多的關(guān)注，在多種疾病治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。但其治療疾病的機制和細胞移植后在宿主體內(nèi)的分布和遷移尚不明確。細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導原則指出，細胞治療產(chǎn)品的藥動學研究內(nèi)容應(yīng)包括細胞的分布、遷移、歸巢和分化。應(yīng)采用一種或多種合適的細胞追蹤方法評價細胞產(chǎn)品的分布、遷移、歸巢及其存續(xù)和消亡特征?？蛇x擇的技術(shù)方法有活體影像技術(shù)、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)和免疫組化技術(shù)等，其中免疫組化學技術(shù)是傳統(tǒng)的組織分布研究技術(shù)，雖已較為成熟，但需在細胞移植后處死動物，取出相應(yīng)組織進行檢測，存在一定局限性。非臨床和臨床的活體影像示蹤技術(shù)的應(yīng)用，可實現(xiàn)無創(chuàng)性實時監(jiān)測移植細胞在宿主體內(nèi)的遷移、分布和存留等，從而有助于開展細胞治療技術(shù)的深入研究和應(yīng)用［4-6］。研究表明，結(jié)合多種無創(chuàng)性成像技術(shù)的細胞標記方法（直接標記或報告基因轉(zhuǎn)染的間接標記）可實時追蹤體內(nèi)標記的細胞，監(jiān)測細胞的遷移、分布以及量化細胞的蓄積和功能。近年來，已有大量關(guān)于細胞在非臨床無創(chuàng)性示蹤方法的研究。本綜述主要對細胞非臨床活體示蹤方法的研究進展進行總結(jié)，從而為細胞治療產(chǎn)品的組織分布、遷移和功能研究提供參考。

1 細胞標記及活體示蹤技術(shù)

為實現(xiàn)對移植細胞的無創(chuàng)示蹤，首先需要以一種能可視化的方式對細胞進行標記。細胞的標記及活體示蹤技術(shù)在細胞移植研究中起著非常重要的作用，目前常用的細胞標記及示蹤方法眾多，主要分為兩大類，即直接細胞標記法和間接細胞標記法。直接標記法是在細胞體外培養(yǎng)時應(yīng)用放射性核素、磁性物質(zhì)、熒光染料等顯像劑直接標記細胞，然后采用正電子發(fā)射計算機斷層成像（positron emission tomography，PET）、單光子發(fā)射計算機斷層成像（single photon emission computed tomography，SPECT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和光學成像等手段進行成像。這些顯像劑通過與細胞表面蛋白結(jié)合或被動擴散進入細胞內(nèi)，與胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的標記，然后再移植到宿主體內(nèi)。這種方法不需要對細胞進行其他修飾，操作簡單。

另一種為間接標記方法，通常依賴于一個報告基因，通過外源報告基因的穩(wěn)定或瞬時表達將報告基因轉(zhuǎn)染到細胞中，整合的報告基因在活細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯，并最終轉(zhuǎn)化為功能酶、受體或光學活性蛋白。然后表達的產(chǎn)物可被可成像的顯像劑靶向結(jié)合并與合適的底物相互作用產(chǎn)生信號，再采用熒光成像（fluorescence imaging，F(xiàn)LI）、生物發(fā)光成像（bioluminescent imaging，BLI）和核素成像等不同的成像方式捕獲該信號［7］。此時，報告基因表達的產(chǎn)物結(jié)合顯像劑后成像，而不是報告基因本身被成像。因此是一種間接標記的方法。目前，最常用的報告基因有螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)luc）基因、單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶（herpes simplex virus type 1 thymidine kinase，HSV1-tk）基因、Luc-2基因和碘化鈉同向轉(zhuǎn)運體（sodium iodide symporter，NIS）等。每種方法各有其優(yōu)缺點，選擇的標記方法應(yīng)具有特異性強、靈敏度高、對細胞或機體影響小、標記和檢測方法簡單易行等特點。本文主要綜述近年來常用的細胞非臨床活體成像方法及其在細胞治療研究中的應(yīng)用。

2 細胞非臨床活體成像方法及應(yīng)用

2.1 核素成像

2.1.1 直接標記

放射性核素用于在細胞移植前進行體外標記，可檢測到pmol甚至更低濃度的放射性標記，同時實現(xiàn)對位置較深的器官的可視化。因此，放射性核素成像方式通常優(yōu)選用于體內(nèi)細胞追蹤。常見的放射性核素有99mTc（半衰期6.08 h）、111In（半衰期2.8 d）、18F（半衰期110 min）、64Cu（半衰期12 h）和89Zr（半衰期3.27 d）等。根據(jù)其物理半衰期不同，可使用成像工具在數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)跟蹤這些同位素標記的細胞?？筛鶕?jù)實際所需觀察的時間決定采用哪種放射性核素。89Zr具有較長的半衰期［8］，可通過PET成像對其標記的細胞進行長期監(jiān)測（表1）。Weist等［9］使用89Zr-oxine標記CAR-T細胞。PET成像結(jié)果表明，89Zr-oxine可用于CAR-T細胞的標記和顯像，同時可保持細胞活力和功能，提示89Zr-oxine用于實時追蹤CAR-T細胞具可行性。Liu等［10］和Asiedu 等［11］分別使用89Zr-oxine 標記內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPC）和骨髓細胞。PET/CT成像結(jié)果顯示，89Zr-oxine可有效標記和追蹤EPC及骨髓細胞，可用于臨床實踐中細胞移植的無創(chuàng)監(jiān)測。還有研究用89Zr-oxine標記EL4小鼠淋巴瘤細胞、DC、細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和NK細胞，通過PET/CT活體成像證明，89Zr-oxine適用于標記多種不同類型的細胞［12］。89Zr還可以和p-NCs-B2-DFO螯合形成89Zr-DBN復合物，通過與細胞膜表面蛋白的伯胺基團共價結(jié)合標記細胞。Bansal等［13］用小鼠黑素瘤細胞、人骨髓MSC和小鼠DC評估89Zr-DBN標記細胞的方法，表明89Zr-DBN是一種生物穩(wěn)定的基于PET活體成像的細胞標記方法。他們隨后還通過PET成像在缺血性心衰小鼠模型中評估89Zr-DBN標記對人心臟造血干細胞的功能（細胞增殖能力、細胞活力、細胞凋亡和放射性流出率等）和治療效果的影響。結(jié)果表明，心臟造血干細胞在89Zr-DBN標記后，很好地保留了細胞特性和治療潛力［14］。還有一些研究報道了其他放射性核素標記MSC的可行性，分別用18F-FEAU，131I-FIAU和99mTc-HMPAO標記細胞，然后使用PET成像技術(shù)監(jiān)測細胞［15-16］（表2）。還有研究表明，111In標記MSC后SPECT成像時 MSC 的體內(nèi)監(jiān)測可長達 10～14 d［17］。用111In-oxine標記離體擴增的NK細胞，并將其注射到結(jié)腸癌患者的肝動脈中，SPECT觀察到NK細胞在惡性病變中蓄積，該研究的局限性在于111In標記NK細胞的標記效率較低（＜60%）［18］（表1）。后來Charoenphun等［19］分別用89Zr-oxine和111In-oxine對3種不同細胞系和人白細胞進行標記，監(jiān)測其標記效率和流出率，發(fā)現(xiàn)89Zr在體外細胞中的保留率明顯優(yōu)于111In。89Zr-oxine為體內(nèi)細胞追蹤的長半衰期PET示蹤劑的需求提供了一種潛在的解決方案。直接標記方法可以很好地觀察到細胞在體內(nèi)的分布及遷移，但顯像劑會隨細胞的代謝和分裂逐漸稀釋或流出，成像時間短，不能用于長期追蹤細胞，且此種方法所使用的顯像劑在過高濃度下會引起細胞毒性。

表1 非臨床成像技術(shù)直接細胞標記示蹤方法

表2 非臨床成像技術(shù)間接細胞標記示蹤方法

2.1.2 間接標記

目前，已有研究開發(fā)了多種基于細胞PET成像的報告基因，如HSV1-tk、人去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體（human norepinephrine transporter）和前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen）［20-23］。然而，由于免疫原性以及在腫瘤部位的背景攝取等因素，只有HSV1-tk在臨床上得到了應(yīng)用。HSV1-tk報告基因可通過磷酸化18F-FHBG〔9-（4-［18F］Fluoro-3-hydroxymethylbutyl） guanine〕產(chǎn)生高能量光子，可用PET檢測。為研究人MSC對微觀腫瘤自殺基因及細胞因子的治療效果，Huang等［24］在MSC中導入HSV1-tK基因，再注射于荷瘤裸小鼠體內(nèi)。PET成像結(jié)果顯示，18F-FHBG標記的MSC趨向腫瘤組織并大量增殖。研究報道，將導入Luc-2報告基因的人MSC（MSC-luc2）iv給予人乳腺癌荷瘤小鼠，從給藥5 h后可持續(xù)成像8周。BLI顯示，MSC-luc2遷移到小鼠乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移組織中，且信號集中在轉(zhuǎn)移瘤上，成功地顯示了MSC向肺轉(zhuǎn)移的歸巢［25］。有研究報道，在動物乳腺癌模型中，iv給予或腫瘤內(nèi)注射表達碘化鈉同向轉(zhuǎn) 運體（sodium iodidesymporter，NIS）的 MSC（NIS-MSC），然后使用SPECT對99mTc進行成像，成功獲得了NIS-MSC在移植動物體內(nèi)的分布圖像［26］。也有研究通過124I-PET成像研究了iv給予NIS-MSC在肝癌小鼠體內(nèi)的分布，72 h后觀察到NIS-MSC在腫瘤中募集［27］。將NIS-MSC注射到攜胰腺腫瘤模型小鼠中，124I-PET成像結(jié)果顯示，124I在小鼠腫瘤中有明顯的蓄積，表明NIS-MSC遷移至腫瘤［28］（表2）。與直接標記方法相比，報告基因轉(zhuǎn)染的間接標記方法能進行體內(nèi)移植細胞的長期示蹤。但缺點是報告基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性差，表達不穩(wěn)定，插入后可能會導致細胞發(fā)生突變甚至形成腫瘤。有些報告基因（如HSV1-tk）作為一種病毒蛋白，具有免疫原性，是宿主免疫系統(tǒng)的作用靶點，會導致報告基因的敏感性降低。

2.2 核磁共振成像

20世紀80年代中期，氧化鐵納米顆粒作為診斷成像的造影劑被開發(fā)出來。過去20年中，已建立了用超順磁性氧化鐵（super paramagnetic iron oxide，SPIO）標記細胞的方法輔助細胞療法的靶向遞送和追蹤。SPIO是一種磁性離子，能產(chǎn)生較強的T2負性對比效應(yīng)，用SPIO標記干細胞后，可通過MRI研究干細胞在體內(nèi)的分布與遷移（表1），已成功用于SPIO標記神經(jīng)干細胞的示蹤［29］。將SPIO標記骨髓來源的DC iv給予C57BL/6雄性小鼠后，通過MRI對小鼠無創(chuàng)示蹤，量化了體內(nèi)DC的遷移特征［30］。SPIO標記的人臍帶MSC在移植后可在宿主脊髓中存活和遷移，從而促進脊髓損傷的恢復，表明SPIO標記的人臍帶MSC移植后的無創(chuàng)性成像是可行的［31］。另有研究對SPIO標記的大鼠MSC進行成像，發(fā)現(xiàn)細胞可在術(shù)后4～8周促進腱-骨愈合［32］。在肝纖維化大鼠模型中，用SPIO標記骨髓來源MSC，MRI信號在移植后15 d仍可檢測到［33］。在腦損傷模型大鼠中，通過SPIO標記和MRI可見，MSC在病變部位停留時間超過30 d［34］。在宮頸癌模型小鼠中，iv給予SPIO直接標記的MSC，通過MRI觀察到標記的MSC在腫瘤部位蓄積［35］。還有研究用SPIO標記內(nèi)皮細胞，通過MRI成功檢測并表征了內(nèi)皮細胞炎癥，為檢測動脈粥樣硬化中的血管炎癥提供了潛在方法［36］。SPIO雖可很好應(yīng)用于MSC移植后的示蹤成像，但其不能長時間停留在標記細胞中，可能會被巨噬細胞吞噬，從而導致MRI顯示結(jié)果不準確。所以，基于SPIO標記的MRI不適合在體內(nèi)長期示蹤移植的MSC［37］。

2.3 光學成像

2.3.1 直接標記

目前使用的熒光染料包括有機染料和無機染料。使用最廣泛的有機染料是一系列明亮的親脂性膜染料，易嵌入生物質(zhì)膜內(nèi)做側(cè)向擴散運動，從而標記細胞膜，有發(fā)出紅色熒光的DiI、遠紅外的DiD和近紅外發(fā)射的DiR。這些示蹤染料對干細胞的歸巢和遷移的影響極小，可在移植后監(jiān)測細胞24～48 h［38］。Wennerberg等［39］在人類黑素瘤模型小鼠中，iv給予親脂性染料DiR標記的NK細胞。熒光成像顯示，DiR標記的NK細胞遷移至黑素瘤部位。Tavri等［40］用另一種親脂性染料DiD標記NK細胞，熒光成像顯示小鼠iv給予NK細胞90 min后，NK細胞向表達人前列腺癌細胞相關(guān)上皮細胞黏附分子的腫瘤遷移。24 h后，有更多NK細胞遷移到腫瘤。有研究者用近紅外熒光團IR-786標記MSC，并將其注射到心肌梗死模型豬中，注射后90 min成功檢測到MSC［41］。常用的其他有機染料包括吲哚菁綠、Cy5.5和PKH26等。Flexman等［42］成功用SPIO和PKH26聯(lián)合標記胚胎神經(jīng)干細胞，將其移植到大鼠腦內(nèi)，可以定量和定性地跟蹤移植后的胚胎神經(jīng)干細胞在腦內(nèi)的遷移。無機染料一般指無機量子點（quantum dots，QD），在激發(fā)時會產(chǎn)生一系列不同的波長，從而發(fā)出熒光。QD標記細胞的優(yōu)點包括高靈敏度和優(yōu)良的分辨率［43］。有文獻報道，QD可以通過被動孵育或者靶向肽介導來標記和監(jiān)測MSC，研究者將QD與Q tracker標記試劑盒一起使用，通過體外模型研究，發(fā)現(xiàn)QD具有生物相容性，并且成功地將帶有QD標記的MSC成功地應(yīng)用到共培養(yǎng)系統(tǒng)中［44］（表1）。

2.3.2 間接標記

通過光學成像技術(shù)檢測熒光蛋白的表達是長期追蹤干細胞移植的有力工具，如Fluc可催化熒光素產(chǎn)生低能量光子（2～3 ev），這些電子可以被Fluc成像系統(tǒng)或采用生物發(fā)光成像系統(tǒng)的電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相機捕獲并成像。當Fluc與底物D-熒光素相互作用時會發(fā)光，該光學信號可被BLI的感光設(shè)備捕獲。Zhu等［45］將Fluc2基因轉(zhuǎn)導至NK細胞，并用BLI技術(shù)追蹤其在具有肺轉(zhuǎn)移或異種移植甲狀腺癌的模型小鼠中的遷移。成像結(jié)果顯示，NK-Fluc2細胞在1 h內(nèi)遷移并浸潤到肺腫瘤中，并停留長達24 h，在48 h時數(shù)量減少。最近的一項研究結(jié)果表明，攜人甲狀腺癌或人乳腺癌小鼠iv給予Fluc2基因轉(zhuǎn)導的人MSC，使用BLI觀察到MSC-Fluc2遷移至甲狀腺和乳腺癌部位［46］（表2）。

生物發(fā)光技術(shù)雖已取得較大進步，但熒光蛋白的激發(fā)和發(fā)射波長較短，組織穿透能力有限，靈敏度不高，且很多報告基因表達不很穩(wěn)定，可能會導致突變發(fā)生，甚至形成腫瘤。這種缺陷可選用熒光染料對干細胞進行直接染色來克服。然而，這種通過光學成像檢測的熒光標記方法很大程度上限于組織表面以下幾百微米，不適用于臨床深層組織成像。為檢測到更深的組織部位，可使用放射性核素標記方法，靈敏度高且不受深度限制［47］。

3 結(jié)語

細胞療法可分為基因修飾療法和非基因修飾療法，前者需要利用基因工程提高細胞療效，如基因修飾的CAR-T細胞等；后者則不需要利用基因工程技術(shù)，包括所有目前批準的干細胞療法和腫瘤浸潤淋巴細胞療法。對于非基因修飾的細胞體內(nèi)追蹤，直接和間接標記之間的選擇取決于研究問題的精準性和實用性，當然還取決于是否需要進行臨床的長期追蹤以及研究目的。通過報告基因轉(zhuǎn)染細胞的間接標記方法，在長期追蹤細胞方面明顯優(yōu)于直接標記，因為它避免了直接標記過程中復雜的劑量學問題（標記物流出、標記物稀釋和觀察時間有限等）。但是，盡管直接標記方法本身具有明顯的缺點，它仍然是目前細胞活體成像領(lǐng)域非常有力的工具。據(jù)報道，通過開發(fā)新一代全身PET/CT掃描儀可能會改善這種缺點。新一代掃描儀增加了覆蓋整個身體的幾何覆蓋率，可以將全身成像的靈敏度提高約40倍，或?qū)蝹€器官成像的靈敏度提高4～5倍［48］。未來使用全身PET/CT掃描儀進行的體內(nèi)細胞示蹤研究將開發(fā)出更安全、更靈敏、半衰期更長的顯像劑，從而在一定程度上延長細胞的追蹤時間。多模式核成像技術(shù)（如PET/CT，SPECT/CT或PET/MRI）由于其高靈敏度且能提供精細的解剖學信息的能力，將成為未來評估體內(nèi)治療性細胞的有力工具。在Clinicaltrials.gov網(wǎng)站上，以“細胞治療”作為關(guān)鍵詞進行臨床試驗的搜索，截止2021年6月1日，全球范圍內(nèi)有多達8830項研究正在進行，以探索不同細胞治療不同疾病的潛力。無創(chuàng)性成像技術(shù)的最新研究進展已將細胞治療領(lǐng)域提升到一個新的水平。通過無創(chuàng)性細胞示蹤技術(shù)，可對細胞治療發(fā)展的幾個關(guān)鍵領(lǐng)域進行定量評估：①治療細胞隨時間在全身的分布；②治療細胞在治療過程中是否遷移到移植部位；③是否發(fā)生靶向非目標組織效應(yīng)；④治療細胞在宿主體內(nèi)的存活時間。值得注意的是，細胞示蹤是基于同一受試者的重復成像。因此，與需要在不同時間點犧牲動物群的傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)通過減少受試者間的差異提供了更好的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。細胞治療給予我們開發(fā)針對癌癥等多種疾病的安全干預策略以新希望，與無創(chuàng)性成像技術(shù)結(jié)合，有助于了解到更多關(guān)于細胞信息以及它們治療疾病的作用機制。