周啟蒙，趙曉悅，孔德文，張 森，張 雯，宋俊科，杜冠華

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

高尿酸血癥是一種體內(nèi)嘌呤代謝失衡引起的代謝性疾病［1］，核心特征是血清尿酸（uric acid，UA）水平男性＞420 μmol·L-1，女性＞360 μmol·L-1。根據(jù)2020年流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國高尿酸血癥患患者約占全國人數(shù)13.3%，是僅次于糖尿病的第二大代謝性疾病［2］。隨著生活水平的提高，患者會越來越多。此外，高尿酸血癥也是痛風(fēng)發(fā)生發(fā)展的核心階段，嚴(yán)重高尿酸血癥患者發(fā)展為痛風(fēng)的風(fēng)險明顯高于輕度高尿酸血癥患者［3］。

目前用于治療高尿酸血癥的藥物主要有黃嘌呤氧化酶抑制類、促尿酸排泄類和尿酸酶類藥物，均存在各自的局限性。競爭性黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇（allopurinol）對亞洲人群HLA-B＊5801表型有相對高發(fā)的嚴(yán)重超敏反應(yīng)綜合征不良反應(yīng)；非競爭性抑制劑非布司他的心血管不良風(fēng)險限制了其臨床應(yīng)用。促尿酸排泄類對肝腎功能有一定要求，此外還有繼發(fā)性結(jié)石風(fēng)險；尿酸酶類藥物注射給藥的給藥方式及對應(yīng)引發(fā)的注射反應(yīng)、個體應(yīng)答差異亦均限制了臨床使用。因而發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)更小的黃嘌呤氧化酶抑制劑是今后此類藥物的研發(fā)方向之一，尋找能溫和降低尿酸的黃嘌呤氧化酶抑制劑有著重要意義。

桑色素（morin），又稱3，5，7，2′，4′-五羥黃酮，常見于?？浦参锏臉淦ぃ瑏碓磸V泛［4］。已有研究表明，桑色素具有抗炎［5-8］、抗氧化［9-13］和抗腫瘤［14-17］等多種藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)，桑色素與銅、鋅、鈷、鎳等二價金屬離子作為催化核心的有關(guān)蛋白合成、核酸轉(zhuǎn)錄等酶有良好的結(jié)合活性［18-22］。尿酸生成的關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化酶亦是鉬離子作為催化核心，由此推測桑色素可能對黃嘌呤氧化酶有一定的結(jié)合作用，但目前關(guān)于桑色素對高尿酸血癥改善作用的研究較少。本研究探討桑色素對高尿酸血癥模型小鼠肝腎功能及血糖和血脂水平的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

桑色素（純度≥85%，批號：MKCG0114）和氧嗪酸鉀（純度：97%，批號：STBF6670V），美國Sigma公司；羧甲纖維素鈉（CMC-Na，300-800 mPa·s，批號20130314），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黃嘌呤、別嘌呤醇、苯溴馬隆和黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO，貨號X4500），美國Sigma Aldrich公司；WST-1，日本同仁化學(xué)公司；UA、肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、白蛋白（albumen，ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamate pyruvate transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetate transaminase，GOT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、血糖（glucose，GLU）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（cholesterin，CHO）檢測試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純。高速冷凍離心機(jī)（AllegraTMX-22R），美國Beckman Coulter公司；生化分析儀（TBA-40），日本東芝公司；多功能酶標(biāo)儀（Spectra max M5），美國Molecular Devices公司。

1.2 溶液配制

① 焦磷酸鈉（SPP）緩沖液：將0.1 mol·L-1焦磷酸鈉加入1 L雙蒸水中，加入0.3 mmol·L-1EDTA，超聲溶解，調(diào)pH至8.3，臨用前配置。②WST-1工作液：將400 μmol WST-1加入1L雙蒸水中，避光保存，臨用前配置。③黃嘌呤工作液：將2 mmol·L-1黃嘌呤加入1 L雙蒸水中混勻。④XO工作液：將2.5×103U·L-1酶液用緩沖液稀釋為15 U·L-1備用。⑤桑色素工作液：將桑色素用雙蒸水樣度稀釋為3×10-3，1×10-3，3×10-4，1×10-4，3×10-5，1×10-5，3×10-6，1×10-6，3×10-7和 1×10-7mol·L-1溶液備用。⑥ 氧嗪酸鉀混懸液（300 mg·kg-1，造模劑）：將氧嗪酸鉀用1% CMC-Na溶液配成60 g·L-1備用。⑦別嘌呤醇組（25 mg·kg-1，陽性對照）、苯溴馬隆組（25 mg·kg-1，陽性對照）和桑色素（25，83和250 mg·kg-1）組：藥物分別用1% CMC-Na溶液分別配成5，17和50 g·L-1備用。

1.3 雙波長動態(tài)監(jiān)測法檢測XO活性抑制率和自由基清除率

體外檢測體系分為標(biāo)準(zhǔn)組、對照組和檢測組。首先在黑色透明底384孔板中每孔添加12.5 μL WST-1工作液和12.5 μL黃嘌呤工作液，標(biāo)準(zhǔn)組每孔添加5 μL SPP緩沖液，對照組每孔添加25 μL SPP緩沖液，檢測組分別每孔添加5 μL桑色素工作液。每濃度4個平行樣，混勻。最后除對照組外，每孔加入20 μL XO工作液，混勻后立刻使用多功能酶標(biāo)儀檢測295 nm處吸光度（A295nm）在20 min內(nèi)動態(tài)反應(yīng)的斜率（S295）及20 min后的A450nm。用S295計算XO活性抑制率。XO活性抑制率（%）=（標(biāo)準(zhǔn)管S295-檢測管S295）/（標(biāo)準(zhǔn)管S295-空白管S295）×100%；自由基清除率（%）=（標(biāo)準(zhǔn)管A450nm-檢測管A450nm）/（標(biāo)準(zhǔn)管A450nm-空白管A450nm）×100%。

1.4 動物、分組、模型制備和血清制備

70只雄性SPF級KM小鼠，體重18～20 g〔北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011〕，置溫控21～25℃、光控（12 h光暗循環(huán)）、濕控（相對濕度20%～50%）的動物實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)方案符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動物倫理委員會要求。小鼠分為7組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、模型+桑色素25，83，250 mg·kg-1組，模型+陽性藥別嘌呤醇25 mg·kg-1組和模型+陽性藥苯溴馬隆各25 mg·kg-1組。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，每3～5 d記錄1次小鼠體重。除正常對照組外，其余小鼠ip給予氧嗪酸鉀300 mg·kg-1，連續(xù)7 d。眼球后靜脈叢取血抽樣檢測血清UA水平，模型與對照組血清UA水平與對照組相比有顯著升高即模型制備成功。成模后維持每日ip給予氧嗪酸鉀300 mg·kg-1。模型小鼠按照分組分別ig給予相應(yīng)藥物，連續(xù)14 d。小鼠在末次給藥1 h后，經(jīng)眼球后靜脈叢取血0.8 mL，而后處死小鼠。血樣室溫自然凝固，隨后4℃，2300×g離心15 min，吸取上清后于-40℃冰箱保存。肝、腎取出后稱重，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量（g）/體重（g）×100。

1.5 生化試劑盒檢測小鼠腎功能和肝功能相關(guān)指標(biāo)

取1.4分組取材處理后獲得的血清樣本，按照試劑盒說明書，使用生化儀檢測血清UA、CRE、BUN、ALB、GLU、LDL-C、HDL-C、TG、CHO含量及GPT、GOT、LDH活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 桑色素體外對XO活性的抑制作用及對自由基的清除作用

如圖1A所示，桑色素體外抑制XO活性最高抑制率為65%，IC50為3.72×10-4mol·L-1；圖1B所示，桑色素對自由基清除率最高為26.7%，EC50為2.3×10-4mol·L-1。

2.2 桑色素對高尿酸血癥小鼠體重的影響

從圖2可見，在實(shí)驗(yàn)期間，正常對照組、模型對照組、模型+桑色素25，83和250 mg·kg-1組，模型+陽性藥別嘌呤醇25 mg·kg-1組及模型+陽性藥苯溴馬隆25 mg·kg-1組小鼠體重?zé)o顯著差異。

2.3 桑色素對高尿酸血癥模型小鼠腎功能的影響

從表1可見，與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清UA顯著升高（P＜0.01），腎指數(shù)、CRE和BUN均無顯著變化。與模型對照組相比，模型+桑色素250 mg·kg-1組血清UA和BUN水平均顯著降低（P＜0.01）；模型+陽性藥別嘌呤醇25 mg·kg-1組血清UA水平顯著降低（P＜0.01）、血清BUN顯著升高（P＜0.05）；模型+苯溴馬隆25 mg·kg-1組血清UA水平顯著降低（P＜0.01），其他腎功能指標(biāo)均無顯著差異。模型+桑色素250 mg·kg-1組血清UA水平與模型+陽性藥苯溴馬隆組相比無顯著差異。

Fig.1 Effect of morin on xanthine oxidase（XO）inhibition and oxygen radical scavenging.The in vitro detection system was divided into the standard group，control group and detection group.A multifunctional microplate reader was used to detect the dynamic response slope（S295）of the absorbance at 295 nm（A295 nm）within 20 min and the A450 nmafter 20 min.XO activity inhibition rate（%）=（standard tubes S295-assay tubes S295）/（standard tubes S295-blank tubes S295）×100%；free radical scavenging rate（%）=（standard tubes A450 nm-assay tubes A450 nm）/（standard tubes A450 nm-blank standard tubes A450 nm）×100%。A：the xanthine oxidase inhibitor rate of morin；B：the oxygen radical scavenging rate of morin.±s，n=4.

Fig.2 Effect of morin on weight of mice during the experiment.Adaptable feeding for 3 d，the mice were randomly divided into 7 equal groups，which were the normal control group，the model group，and the morin 25，83，and 250 mg·kg-1 groups，positive drugs allopurinol and benzbromarone 25 mg·kg-1 groups.After adaptive feeding，the weight of the mice was recorded every 3 or 5 d.Except for the normal control group，the rest of the mice were ip given potassium oxazinate 300 mg·kg-1 for 7 d to prepare a mouse hyperuricemia model in which the level of serum uric acid（UA）in the posterior venous plexus is significantly higher than that in the normal control group.After the model formed，the mice were still ip given potassium oxazinate 300 mg·kg-1.Model mice were given morin 25，83，250 mg·kg-1and positive drugs 25 mg·kg-1each of allopurinol and benzbromarone by Intragastric administration according to their groups for 14 d.Organ index=total organs（g）/weight（g）×100.±s,n=10.

2.4 桑色素對高尿酸血癥模型小鼠肝功能的影響

如表2所示，給藥2周后，與正常對照組相比，模型對照組肝指數(shù)、GPT、GOT、LDH、ALB均無顯著性差異。與模型對照組相比，模型+桑色素3個劑量組和模型+陽性藥組GOT和ALB無顯著差異；25和250 mg·kg-1組GPT水平顯著降低（P＜0.01）；模型+桑色素250 mg·kg-1LDH水平顯著降低（P＜0.01）。與模型對照組相比，模型+陽性藥組肝指數(shù)各指標(biāo)均無顯著差異。

Tab.1 Effect of morin on renal function of model mice with hyperuricemia

Tab.2 Effect of morin on liver function of model mice with hyperuricemia

2.5 桑色素對高尿酸血癥模型小鼠血糖和血脂水平的影響

由表3可見，給藥2周后，與正常對照組相比，模型對照組隨機(jī)血糖升高15%，血脂各指標(biāo)升高5%～40%，但均無顯著差異。模型+桑素色3個劑量組與模型組相比，GLU和血脂各指標(biāo)均無明顯差異。

3 討論

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桑色素對黃嘌呤氧化酶有明顯的抑制作用，其 IC50為 3.72×10-4mol·L-1。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組動物po給予桑色素250 mg·kg-1后血清UA明顯降低，作用與苯溴馬隆無顯著差異。

高尿酸血癥模型小鼠血清BUN、GPT和LDH水平明顯升高，給予桑色素對高尿酸血癥KM小鼠血清BUN水平及GPT和LDH活性有良好的降低作用，提示桑色素對肝、腎功能可能有一定保護(hù)作用。陽性藥別嘌呤醇對上述指標(biāo)無明顯作用，與模型組相比無顯著差異，提示別嘌呤醇對肝、腎功能無明顯改善。

有報道，UA與糖脂代謝、肥胖等密切相關(guān)［23-27］，且在糖脂代謝信號通路的調(diào)控作用中起重要作用［28-29］，這提示調(diào)節(jié)血糖血脂對UA水平可能存在影響。另有報道，桑色素可激活能量代謝相關(guān)的環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A/腺苷酸激活蛋白激酶/沉默信息調(diào)節(jié)因子（cAMP/PKA/AMPK/SIRT1）通路［24］，提示桑色素對機(jī)體血糖血脂水平有一定調(diào)節(jié)作用，但本研究結(jié)果顯示，桑色素對高尿酸血癥KM小鼠血清糖脂水平并未表現(xiàn)出直接顯著改善作用，其降UA作用可能與其他因素相關(guān)。

Tab.3 Effect of morin on serum glucose and lipids level of model mice with hyperuricemia

本研究考察了桑色素對高尿酸血癥KM小鼠血清UA，肝、腎功能及血糖血脂水平的影響，但沒有對體內(nèi)XO活性進(jìn)行檢測，桑色素降低UA的分子機(jī)制研究不夠深入，需要在研究中進(jìn)一步完善。

綜上，桑色素可顯著降低氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥KM小鼠血清UA水平，同時顯著降低血清BUN、GPT和LDH含量，提示其具有一定的肝腎保護(hù)作用，可能成為降尿酸候選藥物。