王曉旭，吳心怡，梁 浩，崔 誠，劉東陽

（北京大學(xué)第三醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，北京 100191）

新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是一種單鏈RNA病毒，主要通過棘突蛋白（spike protein，S蛋白）與宿主細(xì)胞上的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合，與細(xì)胞膜融合和內(nèi)化后進(jìn)入細(xì)胞，然后進(jìn)行脫殼、釋放基因，經(jīng)過一系列翻譯、組裝和復(fù)制過程在宿主體內(nèi)不斷增殖［1］。

疫情暴發(fā)之初，SARS-CoV-2侵入人體的機(jī)制尚未闡明，無法依據(jù)病毒感染機(jī)制進(jìn)行抗SARSCoV-2藥物研發(fā)。因此，基于細(xì)胞和動物模型對已上市的臨床應(yīng)用藥物進(jìn)行治療新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）新適應(yīng)證開發(fā)成為應(yīng)急情況下抗SARS-CoV-2的主要策略。同時(shí)，針對SARS-CoV-2感染機(jī)制進(jìn)行了一系列深入研究，并在此基礎(chǔ)上有針對性地開發(fā)抗SARSCoV-2創(chuàng)新藥物，以期發(fā)現(xiàn)特異性佳且安全有效的新分子實(shí)體。已上市藥物治療COVID-19新適應(yīng)證開發(fā)和基于病毒感染機(jī)制的創(chuàng)新藥物開發(fā)結(jié)果亦可相互印證、相互促進(jìn)，最終實(shí)現(xiàn)有效治療COVID-19的目的。在此過程中，國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)均積累了豐富的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，體現(xiàn)了近年來科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，但面對前所未有的疫情，藥物研發(fā)也遇到了很多困難和挑戰(zhàn)，目前仍無明確的特效創(chuàng)新藥物完成研究并通過藥政部門的審批。

本綜述基于SARS-CoV-2感染機(jī)制的靶點(diǎn)研究進(jìn)展，分別就已上市藥物治療COVID-19新適應(yīng)證和創(chuàng)新藥物開發(fā)現(xiàn)狀進(jìn)行梳理，對其經(jīng)驗(yàn)和不足進(jìn)行總結(jié)，并提出對未來研發(fā)方向和關(guān)鍵問題的思考，以期為我國應(yīng)急情況下新藥開發(fā)提供參考。

1 SARS-CoV-2感染機(jī)制及抗SARS-CoV-2潛在靶點(diǎn)研究

病毒入侵是感染的第一個(gè)環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2可借助其S蛋白與宿主細(xì)胞表面受體ACE2結(jié)合［2］。細(xì)胞膜表面的蛋白酶在組織蛋白酶（cathepsin）B和組織蛋白酶L參與下水解S蛋白［3-4］，隨后SARS-CoV-2與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合，經(jīng)由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并在核內(nèi)體中發(fā)生脫殼釋放病毒RNA，啟動病毒復(fù)制過程。SARS-CoV-2的基因組可以編碼復(fù)制酶、S蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣殼蛋白等。其中，復(fù)制酶由2個(gè)多聚蛋白組成，需要被病毒蛋白酶水解釋放才能發(fā)揮功能。冠狀病毒中有2類蛋白酶，一類為類木瓜蛋白酶（papain-like protease，PLpro），負(fù)責(zé)水解多聚蛋白N端的少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn)；另一類為主蛋白酶（main protease，Mpro），司職水解多聚蛋白C端的大部分位點(diǎn)。在蛋白酶的作用下，多聚蛋白被水解，釋放出RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）等 15個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，組成病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，司職病毒RNA的合成。隨后，病毒RNA轉(zhuǎn)錄成mRNA并合成病毒蛋白。病毒蛋白進(jìn)行組裝后包裹病毒RNA，經(jīng)溶酶體途徑釋放出細(xì)胞，繼續(xù)感染宿主其他細(xì)胞［5］。部分SARS-CoV-2蛋白已成為抗SARS-CoV-2藥物研發(fā)的重要靶標(biāo)。

病毒感染會引發(fā)人體的免疫反應(yīng)，因此從調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的角度，部分免疫相關(guān)蛋白也成為抗病毒藥物研發(fā)的靶標(biāo)。有研究表明，干擾素α和干擾素γ均在細(xì)胞水平表現(xiàn)出抗SARS-CoV-2的作用［6］。此外，核因子E2相關(guān)因子2〔nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2 protein，Nrf2〕激活劑富馬酸二甲酯可通過激活Nrf2-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白（Kelch-like ECH-associated protein）通路發(fā)揮抗SARS-CoV-2作用，且其抗病毒效果并不依賴于干擾素α［7］。另外2個(gè)Nrf2激活劑甲巴多索?。╞ardoxolone methyl）和巴多索隆（bardoxolone）也在Vero細(xì)胞模型上表現(xiàn)出抗SARS-CoV-2活性［8］。托珠單抗（tocilizumab）是一種重組人源化抗人白細(xì)胞介素6受體單克隆抗體，可抑制過度免疫反應(yīng)，已被批準(zhǔn)用于治療嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cells，CAR-T）療法引起的細(xì)胞因子釋放綜合征。SARS-CoV-2引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴釋放綜合征是重癥COVID-19患者死亡的主要原因之一。因此，托珠單抗對過度免疫反應(yīng)的抑制效果也可能有助于抗SARS-CoV-2治療。臨床研究表明，托珠單抗可有效改善重癥COVID-19患者的預(yù)后并降低死亡率［9］。

2 已上市藥物治療COVlD-19新適應(yīng)證的研究

SARS-CoV-2疫情暴發(fā)之初，我國迅速分離了SARS-CoV-2病毒，并建立了SARS-CoV-2感染的細(xì)胞模型，為快速進(jìn)行治療COVID-19藥物開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。按照傳統(tǒng)新藥開發(fā)程序，新藥首先需要經(jīng)過嚴(yán)格的動物有效性、安全性評價(jià)，然后再在少量健康人、少量患者和足夠樣本量的患者體內(nèi)逐步進(jìn)行劑量探索及有效性和安全性評價(jià)，最終為合適的患者推薦具備科學(xué)給藥方案的新藥，這個(gè)過程一般會耗費(fèi)5～10年時(shí)間。在應(yīng)急情況下，COVID-19患者處于無藥可救情形，此時(shí)根本無法允許按照傳統(tǒng)程序開發(fā)救治藥物。應(yīng)急情況下藥物開發(fā)經(jīng)驗(yàn)豐富的美國曾針對炭疽孢子恐怖襲擊下藥物快速開發(fā)發(fā)布動物法則（Animal Rule），提出因倫理道德或不具有可行性等原因，無法獲得臨床數(shù)據(jù)的新藥和新生物制品可以在符合藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（Good Laboratory Practice，GLP）的實(shí)驗(yàn)室完成動物藥效和安全性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上直接申請上市使用，以解決重大疫情或軍事活動時(shí)藥物因時(shí)間和不可操作性所限，不能快速發(fā)揮臨床治療作用的問題［10］。但需要證明驗(yàn)證新藥的動物模型可靠，這在SARS-CoV-2疫情暴發(fā)初期很難達(dá)到，并且新藥在動物體內(nèi)的有效性和安全性評價(jià)需要很長時(shí)間，很難滿足。在選擇抗微生物藥物劑量時(shí)，該指南也建議可采用體外數(shù)據(jù)對人體劑量進(jìn)行外推，這種快速研究方法結(jié)合已上市藥物已有的臨床安全性數(shù)據(jù)的優(yōu)勢，可既能快速推薦有效劑量，又可快速證明該劑量下藥物的安全性，從而快速進(jìn)行驗(yàn)證性臨床試驗(yàn)，以實(shí)現(xiàn)借助“老藥新用”支持其治療患者。

為此，SARS-CoV-2疫情暴發(fā)之初，我國科研工作者即借助細(xì)胞模型快速評估了利巴韋林（ribavirin）、噴昔洛韋（penciclovir）、硝唑尼特（nitazoxanide）、萘莫司他（nafamostat）和氯喹（chloroquine）及2種已知的廣譜抗病毒藥物——瑞德西韋（remdesivir，GS-5734）和法匹拉韋（favipiravir，T-705）對臨床分離SARS-CoV-2株的抗病毒效果，采用標(biāo)準(zhǔn)測定方法檢測上述化合物對SARS-CoV-2的細(xì)胞毒性、病毒產(chǎn)量和感染率的影響，并推薦氯喹和瑞德西韋等為潛在治療藥物，在此基礎(chǔ)上快速進(jìn)行了一系列相關(guān)臨床試驗(yàn)，探索其治療COVID-19的潛在能力，這些臨床數(shù)據(jù)支持了我國早期臨床COVID-19診治指南的出臺［11-13］。利巴韋林、噴昔洛韋、硝唑尼特、萘莫司他和氯喹5種藥物后來在美國也得到了美國食品藥品監(jiān)督管理局快速批準(zhǔn)。同時(shí)，鑒于SARS-CoV-2感染后，人體自身的抗SARS-CoV-2感染能力和抵抗SARS-CoV-2觸發(fā)的炎癥等能力發(fā)生變化，這對臨床治療也非常重要。我國科學(xué)家針對上述情況，對增強(qiáng)先天免疫系統(tǒng)和抑制炎癥反應(yīng)的托珠單抗等已上市藥物快速展開臨床研究。本文按照藥物作用機(jī)制對目前正在開發(fā)的可用于治療COVID-19新適應(yīng)證的已上市藥物和創(chuàng)新藥物進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，按照作用于病毒感染、宿主免疫與治療以及同時(shí)作用于病毒和宿主的機(jī)制將已上市藥物分別列于表1、表2和表3。盡管部分藥物在體外表現(xiàn)出抗SARS-CoV-2活性，但只有較少的雙盲雙對照臨床研究在一定程度上證明了療效，尚未發(fā)現(xiàn)特效藥物。

這種加速臨床開發(fā)的應(yīng)急策略中，基于細(xì)胞數(shù)據(jù)和（或）動物數(shù)據(jù)預(yù)測臨床有效劑量及特定情況下（如肝損傷、腎損傷或兒童患者）劑量調(diào)整方案至關(guān)重要，而本次應(yīng)急開發(fā)中一個(gè)明顯的特色就是模型引導(dǎo)的新藥開發(fā)策略得到了充分應(yīng)用［30］。本課題組與國家疾病預(yù)防控制中心聯(lián)合科研攻關(guān)，依據(jù)細(xì)胞學(xué)抗病毒活性數(shù)據(jù)建立生理藥動學(xué)模型，以當(dāng)時(shí)最新報(bào)道的氯喹唯一臨床試驗(yàn)有效性數(shù)據(jù)（n=22）為基礎(chǔ)，通過總結(jié)羥氯喹臨床使用的藥物劑量-暴露量-安全性規(guī)律，對與氯喹等效的羥氯喹臨床劑量進(jìn)行預(yù)測，保障了氯喹和羥氯喹臨床試驗(yàn)高效安全進(jìn)行［11，31-32］。同時(shí)還用動物實(shí)驗(yàn)探索了羥氯喹在藥效靶部位（肺組織）中的藥動學(xué)特征，基于細(xì)胞學(xué)研究探索了羥氯喹的藥動學(xué)特征和安全性特征，從而預(yù)測了氯喹和羥氯喹在不同特定人群的藥動學(xué)特征，并使用臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證和進(jìn)一步分析，最終為快速推薦兩者在特定人群中的合理使用方案奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)［33-37］。這種策略也被全球同行應(yīng)用于上述藥物其他情形和其他抗SARS-CoV-2藥物開發(fā)中。但在應(yīng)用中需要充分考慮體外模型質(zhì)量及其與患者疾病機(jī)制的相似性、體外藥物與體內(nèi)活性物質(zhì)的相似性、臨床患者病情演變以及病毒臨床特征高度變異對臨床試驗(yàn)的苛刻要求［38-41］。

3 我國中藥用于COVlD-19治療的研究

中藥以復(fù)方的形式給藥，是一種多分子-多靶標(biāo)的系統(tǒng)性治療方法，可以在多個(gè)環(huán)節(jié)同時(shí)阻斷病毒復(fù)制周期，還可以調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)。此外，由于中藥有上千年的人體使用經(jīng)驗(yàn)，其臨床用量和安全性已得到充分探索，且無需化學(xué)合成，易于獲取，是應(yīng)急情況下治療藥物開發(fā)的另一個(gè)重要策略。鑒于中藥的低毒性、可快速獲得性及在控制臨床患者癥狀中的有效作用，從中藥中篩選針對病毒或宿主靶點(diǎn)的活性化合物也是治療COVID-19的潛在策略之一。目前已有中藥治療COVID-19的研究匯總見表4。然而，傳統(tǒng)中藥復(fù)方設(shè)計(jì)多是基于對病證的觀察而非基于明確靶標(biāo)，因此很難清晰闡明其分子機(jī)制，從而降低了中藥的國際認(rèn)可度，影響了中藥在世界范圍內(nèi)的應(yīng)用。對此，一方面需要突破創(chuàng)新中藥臨床研究方法，另外也需要建立系統(tǒng)的中藥數(shù)據(jù)庫，以更高效高質(zhì)地推動中藥臨床研究質(zhì)量，讓中藥發(fā)揮更大作用。

4 治療COVlD-19的創(chuàng)新藥物研發(fā)和前景

治療COVID-19新藥的開發(fā)重點(diǎn)不僅包括直接作用于病毒的廣譜小分子蛋白和抗體，也應(yīng)考慮對已上市或正在開發(fā)的藥物增加COVID-19適應(yīng)證研究。另一類具有巨大抗病毒潛力的新療法是基于RNA的療法。新藥開發(fā)不僅要專注于已知的風(fēng)險(xiǎn)，還必須致力于對易暴發(fā)的病毒家族進(jìn)行先發(fā)制人的研究，最終提供一種縮短暴發(fā)和應(yīng)對之間差距的戰(zhàn)略。如有可能，還應(yīng)著重于門診使用的口服藥物，并確定對抗病毒和免疫介導(dǎo)的病理的聯(lián)合療法，擴(kuò)大治療窗口的有效性和減少耐藥性［46］。

根據(jù)藥渡數(shù)據(jù)庫顯示，截止2021年6月30日，全球正在進(jìn)行Ⅰ期臨床研究的抗SARS-CoV-2新藥研發(fā)，除疫苗外，主要集中在化學(xué)藥（11項(xiàng)）和生物藥（28項(xiàng)），另有3項(xiàng)正在進(jìn)行細(xì)胞治療研究（表5）。

在抗SARS-CoV-2創(chuàng)新藥物研發(fā)中也有我國科學(xué)家的突出貢獻(xiàn)。西湖大學(xué)團(tuán)隊(duì)首先解析出SARS-CoV-2受體ACE2的全長結(jié)構(gòu)，然后針對該結(jié)構(gòu)篩選和設(shè)計(jì)出特異性抑制劑，構(gòu)建了多種ACE2三聚體蛋白，其中T-ACE2與SARS-CoV-2 S蛋白親和力很高，親和力常數(shù)KD＜1 pmol·L-1，同時(shí)極大提高了對病毒的抑制活性，目前該藥正在開發(fā)中［47］。同時(shí)，中國科學(xué)院上海藥物研究所聯(lián)合上?？萍即髮W(xué)和中國科學(xué)院武漢病毒研究所的科學(xué)家通力合作，發(fā)現(xiàn)一類結(jié)構(gòu)新穎、高效、安全的抗SARS-CoV-2候選藥物。該研究是基于冠狀病毒Mpro三維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并合成的2個(gè)擬肽類化合物11a和11b。兩者在體外展示出對SARS-CoV-2 Mpro極佳的抑制活性，具有較好的抗病毒效果，更為重要的是兩者均展示出良好的體內(nèi)藥動學(xué)性質(zhì)和安全性［48］。

另一種新藥快速研究方法可用于分離治療或預(yù)防SARS-CoV-2感染的中和單克隆抗體［49-50］。北京基因組學(xué)高級創(chuàng)新中心利用人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的中和抗體來阻止SARS-CoV-2感染細(xì)胞，從60例康復(fù)患者的血液中分離出抗體后，將中和抗體注射到感染SARS-CoV-2的小鼠體內(nèi)，5 d后病毒載量減少2500倍，表明該類中和抗體可加快COVID-19治愈，甚至可提供短期的SARS-CoV-2免疫［51］。

5 應(yīng)急情況下治療COVlD-19創(chuàng)新藥物開發(fā)的突破與挑戰(zhàn)

與17年前的SARS時(shí)期相比，目前我國的基礎(chǔ)科研能力與新藥非臨床開發(fā)能力得到顯著提升。SARS-CoV-2疫情暴發(fā)之初，我國科學(xué)家迅速反應(yīng)，于2020年2月4日即發(fā)表了SARS-CoV-2感染細(xì)胞模型并篩選出治療COVID-19的潛在藥物，2月18日發(fā)表了建立的SARS-CoV-2感染大鼠模型，3月9日即發(fā)表了新建立的SARS-CoV-2感染恒河猴模型，為治療COVID-19新藥非臨床評價(jià)和疫苗療效評價(jià)迅速奠定了科學(xué)基礎(chǔ)，使已上市藥物治療COVID-19新適應(yīng)證開發(fā)和創(chuàng)新藥物非臨床研究得以快速展開［13，52］。SARS-CoV-2 細(xì)胞受體空間結(jié)構(gòu)的成功解析和虛擬受體的建立，實(shí)現(xiàn)了利用已有藥物庫對治療COVID-19潛在藥物的快速篩選，并為新藥設(shè)計(jì)與開發(fā)系列研究提供了有力支持［47，53］。定量藥理學(xué)是近年來新興的交叉學(xué)科，建模與仿真技術(shù)的應(yīng)用為驗(yàn)證性臨床試驗(yàn)推薦給藥方案，并密切分析疾病病理特征，基于科學(xué)為臨床推薦藥物開發(fā)策略［11，39］，為患者推薦積極的治療方案［12，32，54-55］。與此同時(shí)，藥政管理部門也積極依據(jù)情況發(fā)布疫情期間新藥開發(fā)相關(guān)指南［56］，共同為后續(xù)一系列藥物研發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。

雖然我國疫情控制取得了巨大成功，上述研究成果顯著，最大程度上保證了人民健康，但應(yīng)急情況下新藥臨床開發(fā)還有待改進(jìn)。①我國生物安全防護(hù)三級或四級實(shí)驗(yàn)室數(shù)量較少，雖然可以支持率先做出突破性研究，但病情分析、新藥與疫苗篩選與藥效與安全性臨床前評價(jià)，劑量推薦等研究需求很大，曾一定程度上影響了新藥開發(fā)；②病毒感染機(jī)制及機(jī)體反應(yīng)機(jī)制應(yīng)從一開始就需有計(jì)劃地開展系列研究，雖然不能為當(dāng)時(shí)疫情控制建言獻(xiàn)策，但會有效指導(dǎo)變異病毒的控制以及后續(xù)其他病毒防治策略的制定，尤其是考慮到目前疫情全球化導(dǎo)致的疫情長期化的潛在可能，更需要堅(jiān)定不移地進(jìn)行基礎(chǔ)研究；③治療COVID-19藥物早期臨床開發(fā)對推薦合適劑量至關(guān)重要，但我國本次新藥臨床評價(jià)過程中重視程度仍有待提升，需通過體外實(shí)驗(yàn)支持臨床劑量選擇避免臨床試驗(yàn)的劑量處于“盲試”狀態(tài)。導(dǎo)致上述情況的主要原因包括非臨床細(xì)胞和動物模型資源較少、疫情形勢緊急以及我國目前缺少專業(yè)的定量藥理學(xué)研究平臺和專業(yè)人才培養(yǎng)體系等；④治療COVID-19藥物臨床試驗(yàn)信息化與樣本檢測能力亟待提升，該現(xiàn)狀一定程度上限制了我國臨床試驗(yàn)質(zhì)量和效率，這在疫情期間病房人員嚴(yán)格管控情況下尤為突出。隨著對上述問題認(rèn)識越來越深刻，希望我國能夠借此提高應(yīng)急情況下新藥開發(fā)能力，更好地保障人民健康。