李霖楓，陳重華，李天平

（四川大學(xué)1.華西藥學(xué)院，2.臨床醫(yī)學(xué)院，3.華西醫(yī)院，四川 成都 610041）

乳腺癌是全球女性最常見的侵襲性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性身心健康?！度虬┌Y統(tǒng)計(jì)報(bào)告》［1］顯示，2020年全球新增乳腺癌患者約226萬，發(fā)病率為11.7%，死亡率為30%（68/226）。乳腺癌具有高度分子異質(zhì)性，其中三陰性乳腺癌以雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2陰性表達(dá)為特征，占所有乳腺癌的15%～20%，多發(fā)于絕經(jīng)前女性，癌腫體積大，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度高，預(yù)后相對(duì)最差［2-4］。由于缺乏有效治療靶點(diǎn)且對(duì)內(nèi)分泌治療不敏感，化療仍是目前針對(duì)三陰性乳腺癌唯一有效的全身治療措施，常以蒽環(huán)類、紫杉類和鉑類藥物為首選方案［5-6］。然而，化療藥物存在明顯的不良反應(yīng)，如心臟毒性、骨髓抑制和神經(jīng)損傷等，造成很多患者治療依從性差，生活質(zhì)量下降；部分患者在治療過程中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致化療失敗［4，7］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Ⅱ～Ⅳ期三陰性乳腺癌患者5年生存率明顯低于其他類型乳腺癌［5］。因此，積極尋找有效、低毒的治療藥物是藥物科學(xué)家面臨的重要任務(wù)。

藥用植物在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域占有重要地位，是新化學(xué)實(shí)體開發(fā)的重要資源。臨床上約有1/3藥物來源于天然產(chǎn)物或其衍生物，如抗癌藥紫杉醇和抗瘧藥青蒿素。牛蒡子苷（arctiin，ARC）是中藥牛蒡子的主要活性成分之一，具有抗炎、抗病毒、降血糖、抗腫瘤等藥理作用，可用于防治糖尿病腎病［8-9］。研究表明，ARC能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如前列腺癌、骨髓瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌等［10-12］，提示ARC可能是一種潛在的抗腫瘤藥物。Lee等［13］發(fā)現(xiàn)，ARC是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抑制劑，可誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡。李孝慶等［14］報(bào)道，ARC能降低Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)前列腺癌PC3細(xì)胞發(fā)生非凋亡性死亡。為闡釋ARC對(duì)三陰性乳腺癌的治療作用，本研究探討ARC對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人三陰性乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，資源編號(hào)：3111C0001CCC000016）：接種于含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于5% CO2，37℃恒溫及飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，穩(wěn)定傳代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物、試劑和儀器

ARC（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：N-004-100 mg，純度＞98%）：溶于細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)DMSO配制濃度為100 mmol·L-1儲(chǔ)備液（DMSO終濃度≤0.5%），避光保存于-80℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)取適量?jī)?chǔ)備液，用完全培養(yǎng)基配制濃度為1 mmol·L-1的ARC母液。

RPMI 1640培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：SH30809.01和SH30042.01），美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清（批號(hào)：04-001-1ACS），以色列BI公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)：HY-K0301），美國(guó)MCE公司；細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：KGA512和KGA108），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；GreenNuc?活細(xì)胞胱天蛋白酶3活性檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：C1168S和P0012），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（批號(hào)：ZB-2306和ZB-2305），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；一抗：兔抗人周期蛋白依賴性激酶2（cyclindependent kinases，CDK）單抗、兔抗人CDK4單抗、兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1單抗、小鼠抗人細(xì)胞周期蛋白E1單抗、兔抗人P27 KIP1單抗、兔抗人β肌動(dòng)蛋白單抗（批號(hào)：2546T，12790T，2978T，4129T，3686T和4970T），美國(guó)CST公司。

倒置相差顯微鏡和OBSERVER D1/AX10 cam HRC倒置熒光顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司；CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)Binder公司；EON酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；Cytoflex流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman公司；Mini P-4小型垂直電泳系統(tǒng)和Mini TBC小型濕式轉(zhuǎn)印電泳槽，北京凱元信瑞儀器有限公司；ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活

取200 μL細(xì)胞懸液接種至96孔板（每孔3×104細(xì)胞），貼壁生長(zhǎng)24 h。用不同濃度ARC（100，200，300，400和500 μmol·L-1）處理24，48和72 h，細(xì)胞對(duì)照組不予藥物干預(yù)。加入100 μL CCK8工作液，37℃避光孵育1～2 h，測(cè)定450 nm處的吸光度值（A450nm），計(jì)算各組細(xì)胞存活率。每組設(shè)5復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）=（藥物組A450nm-空白組A450nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A450nm-空白組A450nm）×100%。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以48 h為藥物干預(yù)時(shí)間。

1.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成率

取2 mL細(xì)胞懸液接種至6孔板（每孔2000細(xì)胞），貼壁生長(zhǎng)24 h。加入ARC 25，50，100和200 μmol·L-1處理48 h，細(xì)胞對(duì)照組不予藥物干預(yù)。撤藥后用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)孔板內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見集落時(shí)，終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定，吉姆薩染色液染色15～30 min，計(jì)數(shù)克隆，計(jì)算各組克隆形成率。克隆形成率（%）=克隆數(shù)/細(xì)胞接種量×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布

參照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。取2 mL細(xì)胞懸液接種至6孔板（每孔4×105細(xì)胞），貼壁生長(zhǎng)24 h。加入適量無血清培養(yǎng)基，饑餓處理8 h。藥物干預(yù)（同1.3）48 h。收集細(xì)胞于2 mL離心管中，350×g離心5 min，用預(yù)冷的PBS清洗1～2次，保留細(xì)胞沉淀。用300 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，緩慢滴加至700 μL預(yù)冷的無水乙醇中，混勻后于4℃靜置過夜。洗去固定液，加入300 μL PI/RNA酶A染色工作液，室溫避光孵育30～60 min。上機(jī)檢測(cè)。利用Modfit LT軟件分析細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 熒光顯微鏡觀察胱天蛋白酶3活性

參照GreenNuc?活細(xì)胞胱天蛋白酶3活性檢測(cè)試劑盒說明書。取200 μL細(xì)胞懸液接種至96孔板（每孔3×104細(xì)胞），貼壁生長(zhǎng)24 h。藥物干預(yù)（同1.3）48 h。PBS洗滌1～2次。取適量1 mmol·L-1胱天蛋白酶3熒光耦聯(lián)底物，用完全培養(yǎng)基稀釋至5 μmol·L-1，每孔加入100 μL，室溫孵育15～30 min，每組設(shè)3復(fù)孔，用熒光顯微鏡定性觀察綠色熒光并拍照。綠色熒光越多，表明酶活性越強(qiáng)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

參照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。取2 mL細(xì)胞懸液接種至6孔板（每孔4×105細(xì)胞），貼壁生長(zhǎng)24 h。藥物干預(yù)（同1.3）48 h。收集細(xì)胞于2 mL離心管中，350×g離心5 min，用預(yù)冷PBS清洗1～2次，保留細(xì)胞沉淀。加300 μL結(jié)合緩沖液，吹打混勻，再加 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和 5 μL PI，室溫避光孵育5～15 min。上機(jī)檢測(cè)。利用FlowJo V10軟件分析細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western印跡法檢測(cè)CDK2、CDK4、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋E1和P27Kip1蛋白表達(dá)

收集ARC（100，300和500 μmol·L-1）組和細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞，分別加適量裂解液，冰上裂解30 min，14 000×g離心15 min，收集上清，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。調(diào)整各組蛋白質(zhì)濃度，加適量5×上樣緩沖液，95℃變性5 min。SDS-PAGE垂直凝膠電泳（80V→120 V），200 mA冰浴轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1∶1000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，再次洗膜3次，ECL發(fā)光液顯影。凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶，Image J軟件進(jìn)行積分吸光度值（integrated absorbance，IA）分析，計(jì)算各組目標(biāo)蛋白IA與內(nèi)參蛋白β肌動(dòng)蛋白IA的比值，表示目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ARC對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞存活率的影響

CCK8法結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，ARC 100，200，300，400 和 500 μmol·L-1可 使MDA-MB-453細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01），但同一時(shí)間點(diǎn)各濃度組間并無明顯差異。然而，在同一濃度下，48 h組細(xì)胞存活率明顯低于24 h組（P＜0.05，P＜0.01），72 h組細(xì)胞存活率明顯低于48 h組（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 ARC對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞克隆形成的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，ARC 25 μmol·L-1組MDA-MB-453細(xì)胞克隆形成率明顯降低（P＜0.05），50，100和200 μmol·L-1組克隆形成率顯著降低（P＜0.01），提示ARC能有效抑制該腫瘤細(xì)胞的體外增殖。

Fig.1 Effect of arctiin（ARC）on cell viability of MDAMB-453 cells.MDA-MB-453 cells were incubated with ARC 100，200，300，400 and 500 μmol·L-1for 24，48 or 72 h.Cell viability was detected by CCK8 assay.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol· L-1）group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with corresponding 24 h group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，compared with corresponding 48 h group.

Tab.1 Effect of ARC on clone formation of MDA-MB-453 cells

2.3 ARC對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，MDA-MB-453細(xì)胞經(jīng)ARC 100，200，300，400和500 μmol·L-1處理48 h后，G0/G1期細(xì)胞百分比顯著增加（P＜0.01），S期細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.01），G2/M期細(xì)胞百分比無明顯變化，提示ARC可干預(yù)細(xì)胞周期進(jìn)程。

Fig.2 Effect of ARC on cell cycle of MDA-MB-453 cells by flow cytometry.MDA-MB-453 cells were incubated with ARC 100，200，300，400 and 500 μmol·L-1for 48 h.B was quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（ARC 0 μmol·L-1）group.

2.4 ARC對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞內(nèi)胱天蛋白酶3活性的影響

胱天蛋白酶3熒光染色結(jié)果見圖3，細(xì)胞對(duì)照組處于正常生長(zhǎng)狀態(tài)，胞內(nèi)胱天蛋白酶3活性低，鏡下幾乎未見綠色熒光；ARC各濃度組鏡下也僅可見零星綠色熒光，提示MDA-MB-453細(xì)胞經(jīng)ARC刺激后胞內(nèi)胱天蛋白酶3活性未明顯提高。

2.5 ARC對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞對(duì)照組和 ARC 100，200，300，400 和500 μmol·L-1組細(xì)胞死亡率分別為（5.9±1.6）%，（15.1±1.3）%，（15.1±0.5）%，（12.1±1.1）%，（13.8±2.6）%和（15.0±2.1）%（均P＜0.05）（圖4）。與細(xì)胞對(duì)照組相比，ARC各濃度組凋亡晚期與壞死細(xì)胞百分比顯著升高（P＜0.01），但早凋細(xì)胞百分比無顯著差異，提示ARC可能未誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。

2.6 ARC對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞CDK2、CDK4、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E1和P27蛋白表達(dá)的影響

Western印跡結(jié)果（圖5）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，ARC 100，300和 500 μmol·L-1組 MDA-MB-453細(xì)胞內(nèi)CDK4和細(xì)胞周期蛋白D1蛋白水平明顯下降（P＜0.01），CDK2和細(xì)胞周期蛋白E1無明顯變化；ARC 100和300 μmol·L-1組P27蛋白水平顯著增加（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of ARC on activity of caspase 3 in MDA-MB-453 cells.See Fig.2 for the cell treatment.The cells were fluorescent-stained and observed under a fluorescence microscope（GFP channel，×200）.The more intense green fluorescence，the stronger the caspase 3 activity.

Fig.4 Effect of ARC on apoptosis of MDA-MB-453 cells by flow cytometry.See Fig.2 for the cell treatment.B was quantitative result of A.±s,n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（ARC 0 μmol·L-1）group.

Fig.5 Effect of ARC on protein expressions of cyclin dependent kinases（CDK）2，CDK4，cyclin D1，cyclin E1 and P27 in MDA-MB-453 cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.IA：integrated absorbance.B was semi-quantitative result of A.±s.n=3，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（ARC 0 μmol·L-1）group.

3 討論

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ARC不僅能有效降低MDA-MB-453細(xì)胞的存活率，還可顯著減少單個(gè)細(xì)胞的克隆形成率，提示ARC對(duì)三陰性乳腺癌MDAMB-453細(xì)胞體外增殖能力具有抑制作用，ARC或能應(yīng)用于三陰性乳腺癌的治療。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展通常與細(xì)胞周期異常具有密不可分的關(guān)系。目前，細(xì)胞周期抑制劑已成為三陰性乳腺癌治療策略的研究方向之一，如CDK4/6抑制劑（帕博西尼）對(duì)Rb基因高表達(dá)的三陰性乳腺癌細(xì)胞具有明顯抑制作用［15-18］。本研究結(jié)果顯示，ARC干預(yù)MDA-MB-453細(xì)胞后，S期細(xì)胞百分比明顯下降而G0/G1期細(xì)胞百分比明顯升高，推測(cè)ARC可能干擾細(xì)胞周期進(jìn)程，可導(dǎo)致MDA-MB-453細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。細(xì)胞周期受到精確且復(fù)雜的程序調(diào)節(jié)，其中CDK/細(xì)胞周期蛋白異源二聚體和CDK抑制因子是推動(dòng)細(xì)胞周期運(yùn)行的重要因素。細(xì)胞周期蛋白D是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的重要因素之一，在多數(shù)乳腺癌細(xì)胞中均高表達(dá)［19］。一般而言，細(xì)胞周期蛋白D主要在G1期表達(dá)，能與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，磷酸化Rb蛋白，促進(jìn)E2F轉(zhuǎn)錄因子釋放和一系列相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，協(xié)同CDK2/細(xì)胞周期蛋白E推動(dòng)G1/S期轉(zhuǎn)化［20-21］。P27屬非特異性CDK抑制因子，是G1/S檢查點(diǎn)的關(guān)健分子，能與細(xì)胞周期蛋白D競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4，導(dǎo)致G1期無法向S期轉(zhuǎn)換［22-23］。CDK4和細(xì)胞周期蛋白D表達(dá)降低或P27表達(dá)升高均會(huì)導(dǎo)致G0/G1期阻滯，從而促使腫瘤細(xì)胞增殖抑制。既往研究顯示，ARC可通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)以抑制骨肉瘤、肺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等腫瘤細(xì)胞增殖［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度ARC干預(yù)后MDA-MB-453細(xì)胞內(nèi)P27蛋白水平顯著上調(diào)，CDK4和細(xì)胞周期蛋白D1蛋白水平明顯下調(diào)，CDK2和細(xì)胞周期蛋白E1表達(dá)未受影響，與先前報(bào)道一致［12］。由此可見，ARC可能通過調(diào)控CDK4、細(xì)胞周期蛋白D1和P27的表達(dá)來干擾MDA-MB-453細(xì)胞周期的進(jìn)程。

細(xì)胞凋亡失衡是導(dǎo)致腫瘤無限增殖的另一重要因素，故調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡過程也是腫瘤治療的熱點(diǎn)策略。胱天蛋白酶家族是存在于細(xì)胞質(zhì)中一組具有高度同源性的蛋白酶，在細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色，其中胱天蛋白酶3是細(xì)胞凋亡途徑上的終末剪切酶，可作為標(biāo)志性蛋白反映細(xì)胞凋亡狀態(tài)。研究表明，ARC可通過胱天蛋白酶依賴性線粒體途徑誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤［13］、肝癌［24］和胰腺癌［25］等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而，本研究結(jié)果顯示，MDAMB-453細(xì)胞在經(jīng)過ARC處理48 h后，胞內(nèi)胱天蛋白酶3酶活化水平和早期凋亡水平均無顯著提高，提示凋亡誘導(dǎo)可能并非ARC發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的作用方式。由于ARC組細(xì)胞壞死率較細(xì)胞對(duì)照組有小幅度提升（3.4%→10.0%），推測(cè)ARC或許可造成MDA-MB-453細(xì)胞非凋亡性壞死，與李孝慶等［14］報(bào)道相似，這可能不是造成MDA-MB-453細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的主要原因。

綜上，ARC能有效抑制三陰性乳腺癌MDAMB-453細(xì)胞增殖且可干預(yù)細(xì)胞周期進(jìn)程，其作用機(jī)制可能與下調(diào)CDK4、細(xì)胞周期蛋白D1蛋白水平和上調(diào)P27表達(dá)有關(guān)。本研究擴(kuò)展了ARC在抗腫瘤方面的潛在應(yīng)用，在持續(xù)深入開展機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，ARC有望開發(fā)為一種靶向細(xì)胞周期治療的抗腫瘤藥物。但本研究?jī)H在細(xì)胞水平進(jìn)行了探討，結(jié)果具有局限性，是否存在其他作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。