王朝江, 王世清, 高春燕, 李 慧, 夏偉偉

(河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所,河北 石家莊 050051)

自1992年首例太歲在陜西省周至縣渭河被發(fā)現(xiàn)以來[1]，其分類屬性就成為科學熱點和社會關注點.黃建新等[1]將首例太歲鑒定為“大型粘菌復合體”；但在2010年又進行了自我否定[2]，原因是其后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)太歲主體物質(zhì)為聚乙烯醇，同時含有14.48%多糖，以及細菌、霉菌、酵母和粘菌，認為化工產(chǎn)品與微生物及其代謝產(chǎn)物共存的矛盾，只有從生物代謝與合成的角度才能得到最佳解釋[2].2018年趙雅秋等[3]提出的“脫模物造假說”，無視太歲形態(tài)各異、外具褶皺、內(nèi)多有纖維狀紋理的特征，推定其為建筑膠遺留，但并未提供相應發(fā)現(xiàn)地證據(jù)；2020年Li et al[4]提出的“古老有機物說”，一方面自陷合成聚乙烯醇原因不明的困惑，另一方面，出現(xiàn)了太歲所藏地層在4萬年前尚未形成的矛盾[5-6].另外，這2種假說也無法解釋太歲中細菌分布極不均衡的現(xiàn)象[7-8].因此，太歲生物成因的可能性仍然最大，有待進一步探索.揭秘太歲屬性的關鍵是能否從太歲中分離到具有合成“聚乙烯醇”類物質(zhì)能力的菌種，這依賴于對太歲各類內(nèi)含菌的逐一排查.

太歲中存在真菌已被多次證實：首例太歲中分離到枝頂孢霉屬(Acremonium)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)等種類[9]；其他太歲中分離到假絲酵母(Candidasp.)、粘質(zhì)紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)[10]、卵圓假散囊菌(Pseudeurotiumovale)[11]、白色側(cè)齒霉菌(Engyodontiumalbum)和埃及枝頂孢霉(Acremoniumegyptiacum)[4]等.然而，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離菌類，容易受培養(yǎng)基、培養(yǎng)難易度等因素影響，難以獲得全部真菌，也無法知曉分離菌在整個菌群結(jié)構(gòu)中的地位，且操作污染的干擾常使人懷疑其源自太歲的真實性.高通量測序技術(shù)具有通量高、速度快、準確度高以及運行成本低等特點，能夠快速測知菌群結(jié)構(gòu)，但其正確性易受DNA提取方法影響[8].目前，只有Li et al[4]采用該技術(shù)研究了7個太歲中的真菌，獲知的優(yōu)勢屬為擬青霉屬(Paecilomyces)，同時分離到了腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)，但作者認為其均是來自環(huán)境而非太歲.該研究用常規(guī)方法提取DNA，存在太歲組織未徹底破碎、所含大量多羥基類物質(zhì)未去除的問題，導致結(jié)果不可信[7].所以，有關太歲真菌菌群結(jié)構(gòu)仍有待研究.

鑒于此，本研究采用高通量測序技術(shù)分析太歲中真菌菌群結(jié)構(gòu)，并對分離菌進行DNA驗證，以期為太歲生物成因的揭秘提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試太歲 紅褐色、具尖圓柱體狀太歲，發(fā)現(xiàn)于河南省三門峽市黃河岸邊，浸水保存狀態(tài)下觸感如硬橡皮，內(nèi)部組織致密、褐至淺紅色，2007年底由作者收藏.

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，天津市大茂化學試劑廠，分析純)，溶菌酶(北京索萊寶科技有限公司)，Transgen 2×Taq master Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，DNA檢測試劑盒(Qubit 3.0，Life, America).真菌分離純化培養(yǎng)基為高氏1號培養(yǎng)基[12].

1.1.3 主要儀器與設備 臺式離心機(H1850，湘儀)，電泳儀(DYY-6C型，北京六一)，PCR儀(T100，BIO-RAD)，Miseq高通量測序平臺(2×300，Illumina，美國)，光學顯微鏡(Nikon 80i，日本).

1.2 方法

1.2.1 取樣及DNA提取 用于提取DNA的外層(SFO)組織樣品取自沒有紅褐色分泌物質(zhì)和雜物黏附的部位，切取深度0.5 cm；內(nèi)層(SFI)組織樣品取自表皮下2～3 cm處.每層在2個位置取樣，分別編號.每份樣品稱取0.2 g，切成厚度小于1 mm的碎屑.分離真菌從內(nèi)層組織取樣.取樣按無菌操作規(guī)程進行.

用CTAB法[13]提取DNA.提取前增加了熱水溶解和0.22針頭濾膜(Milex，美國)過濾溶解液處理，用富集菌體的濾膜提取[8].提取時用玻璃杵研爛濾膜.分離真菌DNA用平皿純培養(yǎng)的菌絲體提取.

1.2.2 高通量測序及菌群分析 太歲樣品DNA的高通量測序由生工生物工程(上海)有限公司完成.測序前經(jīng)兩輪擴增建庫：第1輪引物為融合有Illumina Miseq測序平臺的真菌rDNA引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC).PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s, 45 ℃ 20 s, 65 ℃ 30 s，5次循環(huán)；94 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s，20次循環(huán)；72 ℃ 5 min.第2輪擴增引入Illumina橋式引物，產(chǎn)物經(jīng)Qubit3.0 DNA試劑盒定量后，等量混合測序.

測序得到原始序列后，以標簽序列(barcode)區(qū)分不同樣品，經(jīng)Cutadapt軟件拼接、Prinseq[14]軟件質(zhì)控、Uchime軟件過濾嵌合體、Usearch[15]軟件去除非特異性擴增序列后得到優(yōu)質(zhì)序列；優(yōu)質(zhì)序列以97%相似水平劃分OTU(operational taxonomic units).用RDP classifier算法[16]將OTU進行門、綱、目、屬等水平的分類注釋.

用香農(nóng)(Shannon)指數(shù)、Chao1指數(shù)評估樣品中真菌的α多樣性和相對豐度；用覆蓋率(coverage)指數(shù)評價測序數(shù)據(jù)量的真實合理性；用韋恩(Venn)圖軟件統(tǒng)計OTU在樣品中的分布情況.將樣品間共有、具高占比OTU支撐，且相對豐度高的菌群確定為優(yōu)勢菌群[8].

1.2.3 真菌分離及形態(tài)觀察 取樣切成碎屑，加水振蕩15 min，制成濃度為50 mg·mL-1的太歲組織浸提液；每皿涂0.1 mL，20～25 ℃暗室培養(yǎng)10 d.

選擇在不同皿上出現(xiàn)頻次多且非青霉、木霉等常見霉菌的菌落，尖端菌絲純化培養(yǎng).培養(yǎng)期間，每天觀察菌落生長狀況，記錄菌落顏色、形態(tài)變化.用插片法與載片法[17]培養(yǎng)菌絲，光學顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài).

1.2.4 分離真菌的分子鑒定 采用真菌rDNA 18S通用引物NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)、NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)和鐮刀菌屬rDNA ITS特異性引物Fu1(CCGAGTTTACAACTCCCAAA)、Fu2(TCCTCCGCTTATTGATATGC)進行聯(lián)合分子鑒定.NS1、NS8擴增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min， 30次循環(huán)；72 ℃ 10 min.Fu1、Fu2擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；72 ℃ 10 min.運用NCBI中BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對擴增序列進行同源性檢索.在NS1、NS8擴增序列比對結(jié)果中，選擇相似性≥99.30%的種序列，通過MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[18]，步長值1 000；用Fu1、Fu2擴增序列的比對結(jié)果對進化分析結(jié)果做進一步驗證[19].

1.2.5 分離真菌來源的DNA驗證 分離真菌的DNA用高通量測序引物(ITS1、ITS2)擴增，擴增序列經(jīng)NCBI同源性檢索后確定分類歸屬，再與高通量測序結(jié)果中同屬OTU的所有序列進行多序列BLAST相似性比對，根據(jù)高相似性OTU出現(xiàn)及存在情況，判斷分離真菌是否源自太歲.

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌多樣性

從表1中OTU數(shù)目可知，供試太歲中真菌種類豐富；各樣品的OTU數(shù)目及香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)等與預測的趨勢一致，都表現(xiàn)為內(nèi)層高于外層，說明內(nèi)層的真菌多樣性高于外層.另外，4個樣品的覆蓋率均為0.99，說明測序數(shù)據(jù)量幾乎涵蓋了樣品所有物種，能夠代表樣品真實情況.

表1 4個樣品的測序數(shù)據(jù)及α多樣性指數(shù)1)Table 1 Sequencing data and α diversity index in 4 samples

2.2 樣品間OTU關聯(lián)性

從圖1可以看出：樣品間共有OTU僅40個，占各樣品總數(shù)的比例很少；這些共有OTU在SFO2、SFO3、SFI2和SFI3樣品中的相對豐度依次為66.68%、66.32%、41.01%和33.03%，樣品間變幅較大，整體上外層高于內(nèi)層.這說明太歲中OTU多數(shù)為非共有，且內(nèi)層中含有更多與其構(gòu)成無關的種類.

圖1 OTU(個)在4個樣品中分布的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTU distribution in 4 samples

2.3 真菌物種注釋與菌群結(jié)構(gòu)

從表2可以看出：各樣品中的真菌約有10個門、100個以上的屬；按相對豐度≥0.01%統(tǒng)計，目和屬水平上的數(shù)目減少明顯，特別是外層樣品.這說明太歲組織無論內(nèi)層還是外層，在真菌構(gòu)成上都是雜合體；外層有很多相對豐度在0.01%左右的類群存在.

表2 各樣品中按不同相對豐度(RA)水平統(tǒng)計的OTU分類數(shù)目Table 2 OTU classification of different samples based on relative abundance (RA)

門分類水平上，4個樣品中相對豐度≥0.01%的門共涉及 12個，其中6個為共有(含unclassified)，除SFO3外，各包含1或2個獨有門，占比最高的僅0.16%，說明不同樣品間菌群不完全相同.SFO2、SFO3、SFI2和SFI3中相對豐度≥1%的門分別有3、3、5和4個，子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、未分類門(unclassified phylum)為共有門，占比之和依次為99.36%、99.41%、90.86%和93.08%.子囊菌門在各樣本中占比均超過70%，占絕對優(yōu)勢，與Li et al[4]的研究結(jié)果不同，其以未分類門為優(yōu)勢.

目分類水平上，4個樣品中相對豐度≥0.01%的目共涉及56個，其中25個為共有，SFO2、SFO3、SFI2和SFI3分別獨有2、1、7和10個目.各樣品獨有目占比之和最高的為1.41%.SFO2、SFO3、SFI2和SFI3中相對豐度≥1%的目分別有7、9、14和9個，刺盾炱目(Chaetothyriales)、散囊菌目(Eurotiales)、肉座菌目(Hypocreales)、酵母目(Saccharomycetales)、未分類目(unclassified order)為共有目，占比之和依次為77.60%、91.64%、69.23%和72.83%.刺盾炱目和肉座菌目在各樣品中占比均較高.

屬分類水平上，4個樣品中相對豐度≥0.01%的屬共涉及146個，其中32個為共有，SFO2、SFO3、SFI2和SFI3分別獨有8、11、25和35個屬.SFO2和SFO3獨有屬占比之和均在0.23%以下，SFI2和SFI3各為2.97%和39.33%.相對豐度≥1%的優(yōu)勢屬共涉及27個，SFO2、SFO3、SFI2和SFI3中分別有11、14、17和15個(圖2).

圖2 各樣品中相對豐度大于1%的屬分布柱狀圖Fig.2 Genus composition of different samples with relative abundance over 1%

從圖2可以看出，柱狀圖基部的蟲草屬(Cordyceps)、鐮刀菌屬(Fusarium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、未分類屬(unclassified genus)、曲霉科未分類屬(unclassified Aspergillaceae)為共有屬，在SFO2、SFO3、SFI2、SFI3中占比依次為20.50%、30.07%、32.86%、21.19%.同時，共有屬不是各樣品中占比最高的屬，其占比之和均低于60%，不構(gòu)成絕對優(yōu)勢.占比最高的外瓶霉屬(Exophiala，45.33%)主要存在于外層樣品中，內(nèi)層樣品SFI2中未檢測到；占比次高的Anthopsis(22.11%)僅存在于內(nèi)層樣品中；占比第3的叢赤殼科未分類屬(unclassified Nectriaceae, 18.92%)存在于SFI3中，SFI2中未檢測到.這些結(jié)果均與太歲由真菌構(gòu)成的假定相背離，因缺乏一個占比高且在組織中普遍存在的屬.

2.4 共有屬和高占比屬內(nèi)的OTU分布情況

從表3可以看出，每個屬都包含多個OTU，表明存在不同的“種”.共有屬中的蟲草屬、踝節(jié)菌屬、曲霉科未分類屬在各樣品中均具有相同的最高豐度OTU，其占比與屬占比很接近，表明其構(gòu)成的主“種”相同，是真正的共有屬，但其在4個樣品中占比之和依次降為11.13%、11.53%、25.19%和16.14%；鐮刀菌屬在內(nèi)層樣品中具共有OTU，占比為屬占比的一半，外層無共有OTU，各自占比與屬占比接近，表明在不同的層次位置，該屬的“種”存在大的變化；未分類屬的最高豐度OTU占比與屬占比相差很大，表明該屬的優(yōu)勢由眾多低占比OTU累積而成，是假共有屬.其他非共有屬在各樣品中均有高占比的相同OTU，占比在不同樣品間存在較大變幅.

表3 相對豐度≥1%的共有屬和相對豐度最高值≥10%的非共有屬內(nèi)的OTU分布情況1)Table 3 OTU number and percentage of common genera with ≥1% relative abundance and uncommon genera with highest relative abundance being ≥10%

2.5 分離真菌的形態(tài)特征與分子鑒定

將分離真菌命名為SZB，其在PDA培養(yǎng)基上的菌落圓形、白色(圖3A、3B)，氣生菌絲薄絨狀，間有墨綠色素，隨傳代消失；可產(chǎn)生圓形厚垣孢子(圖3C)，形成菌絲環(huán)、菌絲巢，上附大量小孢子(圖3D、3E).典型鐮刀狀大型分生孢子少，有的呈馬特型，兩端較鈍，基胞有圓形足跟，具0～6個隔膜，大小為(28.2～40.6) μm×(5.8～7.2) μm；小型分生孢子多，長橢圓至卵形，有的具1個隔膜，大小為(9.6～14.7) μm×(4.3～5.3) μm，多假頭生于菌絲尖端和堆積于菌絲環(huán)、菌絲巢處(圖3F).

A、B.菌落正反面；C.大、小孢子與厚垣孢子；D、E.菌絲巢與小孢子；F.頭狀孢子堆.標尺=50 μm.圖3 分離真菌菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)Fig.3 Colony morphology, sporogenous structure and spore morphology of the isolated strain

用引物NS1、NS8擴增SZB所得序列(SZBNS18)的GenBank登錄號為MN508437.1.經(jīng)BLAST比對獲得高相似性同源序列，以鐮刀菌屬同目(肉座菌目)不同科、屬的球孢蟲草(Cordycepsbassiana, AB079126)、Cordycepscateniobliqua(NG062658)作外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.圖4顯示：所有鐮刀菌屬聚為一大類，支持率100%；鐮刀菌屬以下基本按不同的種各聚為一類，SZB與腐皮鐮刀菌聚為一類，支持率為86%.

圖4 基于18S rDNA 基因構(gòu)建的分離菌和相似種系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of isolates and similar species based on 18S rDNA sequence

用引物Fu1、Fu2擴增SZB所得序列的GenBank登錄號為MT825571，長度506 bp.比對結(jié)果顯示，該序列與分離自杏鮑菇(Pleurotuseryngii)的一株腐皮鐮刀菌(登錄號：MK402158.1)序列的序列覆蓋率(query over)為99%，期望值(E-value)為0，相似性(per. ident)為99.01%.

綜合SZB的形態(tài)、系統(tǒng)發(fā)育樹和屬內(nèi)序列比對結(jié)果，將其鑒定為腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani).

2.6 分離真菌來源的檢驗

用引物ITS1、ITS2擴增SZB所得序列(SZBITS12)的GenBank登錄號為MN508438.經(jīng)比對，其與鐮刀菌屬未定種(Fusariumsp., LN809062.1)序列同源性最高.因此，SZBITS12可與高通量測序結(jié)果中鐮刀菌屬OTU進行比對.

從表4可以看出，SZBITS12序列與OTU802序列相似性為100%.OTU802存在于4個樣品中，在內(nèi)層樣品SFI2和SFI3中占比分別為0.08%和0.13%，在外層樣品SFO2和SFO3中占比分別為0.33%和13.88%.這表明分離菌SZB源自太歲，不是外源污染菌.

表4 SZB與同屬OTU同源性比對結(jié)果Table 4 Homology comparison of SZB and OTU from the same genus

3 討論

3.1 真菌非均勻分布提示存在生長與環(huán)境的互作

相對豐度≥0.01%的146個屬中，有114個為非共有屬；≥1%的5個共有屬經(jīng)OTU檢驗后僅余3個；占比高的屬在樣品不同層間或同層次不同重復間跳躍性存在.這種分布不均衡特點表明太歲生長可能與環(huán)境菌群存在互作關系：太歲周邊環(huán)境菌群不均衡，造成同層樣品間的菌群存在差別；周邊環(huán)境菌群會被處于不同生長階段的太歲黏附和裹挾，菌群的變化導致不同層次間的菌群存在差別.這種互作導致了太歲真菌種類和豐度的多樣性.4個樣品中鐮刀菌屬的幾個主OTU，在相對豐度≥0.01%時都為共有，只是由于環(huán)境變化，未形成同一OTU的優(yōu)勢地位.

真菌分布不均衡特點進一步印證了細菌不平衡存在的真實性[7-8].然而， “脫模物造假說”[3]和“古老有機物說”[4]均認為太歲是一個化工產(chǎn)品構(gòu)成的靜態(tài)物體，前者認為其中的菌類為加工用水攜帶，并未考慮脫模加工過程必有的攪拌操作會導致菌類及豐度分布的均勻化；后者則解釋其中的菌類為環(huán)境滲透，并未注意到菌體難以滲入結(jié)構(gòu)致密的化工膠體，即使?jié)B入，菌群將形成以聚乙烯醇分解菌為主、整體多樣性劇降的結(jié)構(gòu).這均與本研究中菌群多樣性外低內(nèi)高的結(jié)果不符.

3.2 真菌的土壤生境特點印證太歲出自土層

中國報道的蟲草屬有139個，其寄主包括昆蟲綱、蛛形綱和大團囊菌屬(Elaphomycessp.)[20].昆蟲幼蟲如蛾幼蟲、金龜子幼蟲、蟬若蟲，成蟲如螻蛄、螞蟻，蛛形綱的穴居蜘蛛的生境都是土層；大團囊菌更是典型的地下生態(tài)類群[21].這說明蟲草屬真菌廣泛存在于土層中.踝節(jié)菌屬、曲霉科未分類屬、叢赤殼科未分類屬真菌均是植物根際和土壤中常檢測到的優(yōu)勢類群[22-23]；Naganishia則是淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)中酵母菌的優(yōu)勢屬[24]；鐮刀菌屬更是一類世界性分布的真菌，它可以在土壤中越冬、越夏[25-26].這些真菌以土壤為生境的構(gòu)成特點，印證太歲出自土層的結(jié)論[27]是正確的.

3.3 太歲中存在一些常規(guī)真菌屬于普遍現(xiàn)象

本研究通過DNA檢驗的方法除證實了腐皮鐮刀菌的存在外，還檢測到了枝頂孢霉屬、木霉屬、青霉屬[9]、假絲酵母屬、紅酵母屬真菌[10]，且為4個樣品共有，相對豐度分別為1.40%、0.11%、0.21%、1.61%、1.92%；但未檢測到假散囊菌屬[11]、側(cè)齒霉菌、擬青霉屬[4].這說明太歲中存在常見真菌屬普遍現(xiàn)象，該現(xiàn)象可由太歲以1 m深土層為主的分布規(guī)律獲得解釋[22]；但真菌種類會因環(huán)境的影響而存在差別，這也證明太歲中真菌是由于保藏階段污染造成的結(jié)論[4]是錯誤的.綜上所述，本研究認為今后應堅持以生物成因為方向?qū)μ珰q進行揭秘.