周賓 馮濤 劉曉 任仙

癲癇由腦部神經(jīng)元同步化異常放電、神經(jīng)興奮性異常增高所致，具有短暫性、發(fā)作性以及重復(fù)性等特點(diǎn)，持續(xù)反復(fù)發(fā)作可損傷腦組織，引起認(rèn)知功能障礙，影響患者正常生活和工作，并可增加意外事件發(fā)生風(fēng)險[1]。癲癇發(fā)作早期神經(jīng)元損傷具有可逆性，通過相應(yīng)治療可挽救受損細(xì)胞，發(fā)作中晚期，神經(jīng)元損傷轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡嫘?，治療只能挽救部分神?jīng)元，因此在癲癇發(fā)作早期應(yīng)及時采用藥物治療防治癲癇發(fā)作[2]。傳統(tǒng)藥物治療癲癇，可在一定程度緩解患者癥狀，但治療效果有限，部分患者甚至癥狀加重，產(chǎn)生認(rèn)知及情感障礙等并發(fā)癥。研究結(jié)果顯示，大麻二酚、地塞米松等具有抗炎作用，可降低癲癇發(fā)作頻率，這為靶向炎癥治療阻止癲癇進(jìn)展提供了新思路[3-4]。鐵皮石斛多糖(dendrobium officinale polysaccharides，DOP)為傳統(tǒng)中藥鐵皮石斛主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等作用[5]。目前，有關(guān)DOP在抗癲癇方面的研究尚少，其在抗癲癇中的作用機(jī)制尚不明確。該研究探討了DOP抗癲癇作用及其可能機(jī)制，為臨床治療癲癇提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物SPF級Wistar雄性大鼠85只，7周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005。置22℃～25℃、相對濕度50%～70%的清潔通風(fēng)環(huán)境飼養(yǎng)，12 h/12 h明暗交替，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實驗過程符合3R原則。

1.2 主要試劑DOP為西安中科達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品，大鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗大鼠核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)p65、p-NF-κB p65，NF-κB抑制蛋白α(NF-κB inhibitor protein alpha，IκBα)、p-IκBα、p-NF-κB p65、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2gene，Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assoaciated X protein，Bax)一抗以及HRP標(biāo)記的二抗購自美國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1癲癇模型制備：隨機(jī)取70只大鼠制備癲癇模型，余15只大鼠為對照組。給予模型組大鼠按體重127 mg/kg腹腔注射氯化鋰，20 h后按體重1 mg/kg皮下注射東莨菪堿，30 min后按體重50 mg/kg腹腔注射毛果蕓香堿。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水。采用Racine分級[6]標(biāo)準(zhǔn)判定癲癇發(fā)作級別，4級持續(xù)30 min以上進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)視為建模成功，SE持續(xù)2 h后，按體重10 mg/kg腹腔注射地西泮終止癲癇。最終建模成功64只，隨機(jī)分為癲癇模型組、丙戊酸鈉組及DOP低、高劑量組，各16只。造模成功當(dāng)天，分別給予DOP低劑量(200 mg/kg)組、DOP高劑量(400 mg/kg)組和丙戊酸鈉組(0.94 g/kg)灌胃干預(yù)，1次/d，連續(xù)4周，對照組和癲癇模型組按相同方式給予等量生理鹽水。

1.3.2行為學(xué)觀察：末次干預(yù)12 h后，觀察各組大鼠癲癇發(fā)作情況，記錄首次發(fā)作潛伏期(末次干預(yù)12 h開始至首次出現(xiàn)4級以上癲癇發(fā)作時間)。

1.3.3Morris水迷宮實驗：行為學(xué)觀察后，采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠認(rèn)知能力。(1)定位航行實驗(測試學(xué)習(xí)能力)：將大鼠放至任一入水點(diǎn)，游至平臺時間即為逃避潛伏期，若未能在120 s內(nèi)游至平臺，則引導(dǎo)其爬至平臺，連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄第6天逃避潛伏期。(2)空間探索實驗(測試空間記憶能力)：第7天撤去平臺，以距平臺最遠(yuǎn)象限為入水點(diǎn)，記錄大鼠120 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)。

1.3.4海馬組織炎癥因子檢測：每組隨機(jī)取5只大鼠，腹腔注射1%(質(zhì)量濃度)戊巴比妥鈉麻醉，斷頭取腦，分離海馬組織，制備組織勻漿。按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-1β、TNF-α水平。

1.3.5海馬神經(jīng)元存活情況：每組隨機(jī)取5只大鼠，剝離海馬組織，以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛固定72 h，石蠟包埋，切片(片厚4 μm)，二甲苯透明、酒精脫水，Nissl染色液37℃染色30 min，水洗，風(fēng)干，二甲苯透明，中性樹膠封片，置顯微鏡下觀察并計數(shù)存活神經(jīng)元數(shù)目。

1.3.6TUNEL染色：取海馬切片，脫蠟至水，加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H2O2反應(yīng)5 min，依次加入蛋白酶K孵育30 min，TUNEL液孵育60 min，3%(質(zhì)量濃度)BSA孵育20 min，POD轉(zhuǎn)換液反應(yīng)30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。置顯微鏡下觀察神經(jīng)元凋亡情況，并計算凋亡指數(shù)(棕色凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.3.7Western blot檢測：處死各組剩余大鼠，剝離海馬組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；蛋白變性，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜；將膜放入5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入 1∶1000稀釋的IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗室溫孵育1 h，洗膜；ECL發(fā)光，掃描圖片。計算目的蛋白相對表達(dá)水平(目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組癲癇發(fā)作潛伏期比較與癲癇模型組比較，DOP低劑量組、DOP高劑量組和丙戊酸鈉組發(fā)作潛伏期延長(P<0.05)；與DOP低劑量組比較，DOP高劑量組和丙戊酸鈉組發(fā)作潛伏期延長(P<0.05)；DOP高劑量組和丙戊酸鈉組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 Morris水迷宮實驗結(jié)果與對照組比較，癲癇模型組大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與癲癇模型組比較，DOP低劑量組、DOP高劑量組和丙戊酸鈉組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)；與DOP低劑量組比較，DOP高劑量組和丙戊酸鈉組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)；DOP高劑量組和丙戊酸鈉組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期和Morris水迷宮檢測結(jié)果比較

2.3 海馬組織IL-1β和TNF-α水平比較與對照組比較，癲癇模型組海馬組織IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)；與癲癇模型組比較，DOP低劑量組、DOP高劑量組和丙戊酸鈉組IL-1β、TNF-α水平降低，DOP高劑量組和丙戊酸鈉組低于DOP低劑量組(P<0.05)；DOP高劑量組和丙戊酸鈉組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

2.4 海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活情況與對照組比較，癲癇模型組海馬神經(jīng)元存活數(shù)減少，神經(jīng)元凋亡指數(shù)高(P<0.05)；與癲癇模型組比較，DOP低劑量組、DOP高劑量組和丙戊酸鈉組海馬神經(jīng)元存活數(shù)增加，凋亡指數(shù)降低(P<0.05)；與DOP低劑量組比較，DOP高劑量組和丙戊酸鈉組神經(jīng)元存活數(shù)高，凋亡指數(shù)低(P<0.05)；DOP高劑量組和丙戊酸鈉組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2、圖1～2。

表2 各組大鼠海馬組織炎性因子及神經(jīng)元存活情況比較

注：A：對照組；B：癲癇模型組；C：DOP低劑量組；D：DOP高劑量組；E：丙戊酸鈉組圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活情況(Nissl染色)

注：A：對照組；B：癲癇模型組；C：DOP低劑量組；D：DOP高劑量組；E：丙戊酸鈉組圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況(TUNEL染色)

2.5 海馬組織蛋白表達(dá)與對照組比較，癲癇模型組海馬組織p-IκBα、p-NF-κB p65、Bax蛋白表達(dá)高，Bcl-2蛋白表達(dá)低(均P<0.05)；與癲癇模型組比較，DOP低劑量組、DOP高劑量組和丙戊酸鈉組p-IκBα、p-NF-κB p65、Bax蛋白表達(dá)低，Bcl-2蛋白表達(dá)高(P<0.05)；與DOP低劑量組比較，DOP高劑量組和丙戊酸鈉組p-IκBα、p-NF-κB p65、Bax蛋白表達(dá)低，Bcl-2蛋白表達(dá)高(P<0.05)；DOP高劑量組和丙戊酸鈉組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3、圖3。

圖3 各組大鼠海馬組織蛋白表達(dá)電泳圖(Western blot)

表3 Western blot法檢測各組大鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

研究結(jié)果顯示，癲癇患者腦組織炎癥因子水平明顯升高，并可與神經(jīng)元相互作用，促進(jìn)癲癇進(jìn)入惡性循環(huán)[7]。癲癇發(fā)作后，患者可出現(xiàn)不同程度認(rèn)知受損。動物模型證實癲癇發(fā)作后其空間記憶能力及探索行為明顯下降[8-9]。海馬組織參與記憶、情感等重要認(rèn)知功能，其神經(jīng)元損傷可引起海馬結(jié)構(gòu)完整性丟失，是導(dǎo)致海馬相關(guān)認(rèn)知功能下降的重要原因之一[10]。炎癥與癲癇進(jìn)展及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，干擾炎癥通路可為治療癲癇提供新的治療途徑。

炎癥及癲癇均可激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)，分泌大量IL-1β和TNF-α等活性物質(zhì)，增加海馬神經(jīng)元興奮毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致海馬組織丟失，引發(fā)認(rèn)知功能障礙，干擾炎癥通路可能為治療癲癇提供新的治療途徑。既往研究證實，DOP在慢性萎縮性胃炎及結(jié)腸炎動物模型中具有明顯抗炎作用[11-12]。該研究結(jié)果顯示，模型組大鼠處于癲癇發(fā)作期，經(jīng)治療后，DOP低、高劑量組和丙戊酸鈉組海馬組織炎癥因子水平下降，發(fā)作潛伏期延長，學(xué)習(xí)記憶能力提高，海馬神經(jīng)元存活數(shù)目增加，凋亡減少，且DOP高劑量組和丙戊酸鈉組效果無統(tǒng)計學(xué)差異，提示DOP可減輕癲癇大鼠腦組織炎癥，改善海馬神經(jīng)元損傷，維持海馬認(rèn)知功能，發(fā)揮抗癲癇作用。另有研究顯示，DOP可抑制海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化，改善阿爾茲海默病小鼠認(rèn)知功能，表明DOP具有神經(jīng)保護(hù)作用[13]。由此推測DOP通過抑炎作用保護(hù)神經(jīng)海馬神經(jīng)元，發(fā)揮抗癲癇效果，然而其確切機(jī)制尚不清楚。

NF-κB在炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。典型NF-κB是由p50和p65組成的異源二聚體，p50結(jié)合DNA，p65參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。IκBα參與調(diào)節(jié)NF-κB活性，靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與IκBα結(jié)合成無活性三聚體存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，阻止NF-κB與DNA結(jié)合。當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到IL-1β、TNF-α等因素刺激時，IκBα磷酸化活化后被降解，NF-κB解離進(jìn)入細(xì)胞核，p65磷酸化活化，參與調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB通路參與癲癇發(fā)生發(fā)展過程，針對癲癇患者術(shù)后腦組織切片的研究顯示，海馬組織中NF-κB過度表達(dá)，表明NF-κB參與癲癇形成過程，推測其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與海馬神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，與癲癇進(jìn)展密切相關(guān)[14-15]。抑制NF-κB信號通路，可減少大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)損傷[16]。Bcl-2和Bax基因?qū)儆贐cl-2家族，分別為抑凋亡基因和促凋亡基因，二者可結(jié)合形成同源或異源二聚體參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果顯示，癲癇模型組大鼠NF-κB信號通路被激活，Bax表達(dá)升高，經(jīng)DOP和丙戊酸鈉治療后，p-IκBα和p-NF-κB p65表達(dá)明顯下降，Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)下降，提示DOP可能通過抑制NF-κB信號通路減輕炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癲癇作用。NF-κB通路在癲癇中發(fā)揮重要作用，抑制該通路可為治療癲癇尋找新的治療靶點(diǎn)[17]。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，DOP可明顯改善癲癇大鼠認(rèn)知功能，減輕海馬炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)揮抗癲癇作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)，這為臨床治療癲癇提供了新的靶點(diǎn)和實驗依據(jù)。