俞明楊 趙夢茹 田童 張倩霞 張雨萌 楊穎博 肖保國 肖偉

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，以神經(jīng)炎癥、脫髓鞘和軸突丟失為主要病理學(xué)特點(diǎn)[1]。雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone，CPZ)是一種銅離子螯合劑，可靶向誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡而引發(fā)中樞髓鞘脫失，常用于髓鞘脫失及保護(hù)再生的研究[2]，用其誘導(dǎo)的脫髓鞘動物模型可模擬MS的病理變化。銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)是一種銀杏二萜內(nèi)酯單體，是銀杏葉提取物的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗血管生成和防治阿爾茲海默等作用[3]。作者團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射GB可保護(hù)CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠的髓鞘脫失和行為異常[4]。然而，脫髓鞘疾病作為神經(jīng)系統(tǒng)慢性病，需要長期治療，靜脈注射用藥并不合適。近年來，口服給藥已成為脫髓鞘疾病新藥的研發(fā)趨勢。本研究探索了口服GB對CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘模型小鼠髓鞘的保護(hù)作用，旨在為MS的治療提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物和BV-2細(xì)胞選取8周齡雄性C57BL/6小鼠24只，體重18～22 g，購自上海西普爾必凱實(shí)驗動物有限公司，飼養(yǎng)于室溫23～25℃、濕度(50±5)%、光/暗循環(huán)12 h的SPF級動物房，自由飲水與進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為正常組、CPZ模型組、GB干預(yù)組，每組8只。動物實(shí)驗操作得到江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司倫理委員會批準(zhǔn)通過。BV-2細(xì)胞購自武漢大學(xué)，使用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至70%～80%時進(jìn)行實(shí)驗。

1.2 主要試劑和儀器CPZ、固藍(lán)(LFB)和脂多糖(LPS)購于美國 Sigma 公司，兔抗小鼠鈣離子結(jié)合銜接分子1(Iba-1)和兔抗小鼠β-tubulin、Alexa Flour 488標(biāo)記的山羊抗兔、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔購自美國CST公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6試劑盒購于R&D System，BCA試劑盒和Griess試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和雙抗購自美國賽默飛公司。GB由江蘇康緣藥業(yè)中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室制備，純度>99%。將GB溶解于0.5%(質(zhì)量濃度)CMC-Na溶液中，濃度為2 mg/mL，超聲30 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。主要儀器包括冷凍切片機(jī)(LEICA CM 1950)、熒光顯微鏡(LEICA DM6 B)、化學(xué)發(fā)光儀(BIO-RAD ChemiDocTMXRS+)和酶標(biāo)儀(美谷生物 i3x)。

1.3 方法

1.3.1造模：以含0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CPZ的飼料連續(xù)喂食6周進(jìn)行造模。正常組小鼠以常規(guī)飼料連續(xù)喂食6周；GB干預(yù)組小鼠于造模開始的第3周時給予250 μL GB溶液灌胃，正常組和模型組小鼠給予等量0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CMC-Na溶液灌胃，連續(xù)4周。

1.3.2行為學(xué)檢測：造模第6周進(jìn)行行為學(xué)檢測。(1)高架十字迷宮實(shí)驗：記錄小鼠在開臂所在時間百分比、進(jìn)入開臂次數(shù)和在開臂內(nèi)的總路程，評估各組小鼠焦慮行為[5]。(2)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗：記錄小鼠在水中的總不動時間、速度和總游泳距離，評估小鼠抑郁行為[6]。(3)T迷宮實(shí)驗：記錄小鼠進(jìn)入另一臂的正確次數(shù)，計算正確率，評估小鼠認(rèn)知行為[7]。

1.3.3組織準(zhǔn)備：喂食第6周末，將小鼠以10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛麻醉。每組隨機(jī)取4只小鼠，心臟灌注生理鹽水，再灌注4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定，取腦置30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖溶液中脫水，直至腦組織沉底，OTC包埋，液氮速凍，采用冷凍切片機(jī)行腦組織切片(片厚10 μm)，置-80℃冰箱備用，進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色。各組余小鼠麻醉后僅灌注生理鹽水，取腦組織置-80℃冰箱備用，進(jìn)行Western blot 和 ELISA 檢測。

1.3.4細(xì)胞實(shí)驗：BV-2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(5×105/mL)，隨機(jī)分為正常組細(xì)胞、模型組細(xì)胞和GB干預(yù)組細(xì)胞。模型組細(xì)胞：加入0.1 μg/mL LPS培養(yǎng)24 h；GB干預(yù)組細(xì)胞：加入50 μg/mL GB和0.1 μg/mL LPS共同培養(yǎng)24 h。

1.3.5髓鞘染色：腦切片經(jīng)蒸餾水清洗后，放入0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))LFB染液中60℃過夜，第2天經(jīng)蒸餾水和95%(體積分?jǐn)?shù))酒精漂洗，以0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))碳酸鋰溶液分色，70%(體積分?jǐn)?shù))酒精繼續(xù)分色，蒸餾水清洗后，置正丁醇中脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下拍照，采用Image J軟件分析髓鞘染色平均光密度值。

1.3.6免疫熒光染色：腦切片置室溫下用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA封閉30 min。PBS漂洗1～2次后，添加兔抗Iba-1(1∶1000)，置4℃過夜。第2天，PBS漂洗后，添加Alexa Flour 488標(biāo)記的熒光二抗(1∶1000)，室溫避光2 h。顯微鏡下雙盲觀察并拍照，用Image J軟件分析Iba-l+陽性細(xì)胞面積百分比，表示小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)。

1.3.7Western Blot檢測：腦組織用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。經(jīng)5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉后，加入β-Tubulin(1∶1000)和Iba-1 抗體(1∶1000)置4℃過夜。第2天，TBST洗膜4次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5000)室溫孵育 1 h。TBST洗膜4次，加入ECL發(fā)光液顯色。分析條帶灰度值，以Iba-1/β-tubulin比值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)相對水平。

1.3.8ELISA檢測：采用雙抗體夾心法，根據(jù)試劑盒說明書檢測各組小鼠腦組織提取液和BV-2細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β濃度。

1.3.9NO水平檢測：采用Griess試劑法，根據(jù)NO測定試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞NO水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Turkey檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。取a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)比較結(jié)果見表1。與正常組比較，CPZ模型組開臂所在時間百分比、進(jìn)入開臂次數(shù)、在開臂內(nèi)的總路程減少(P<0.01或P<0.05)，在水中不動時間延長(P<0.01)，游泳速度和距離降低(P<0.05或P<0.01)，進(jìn)入另一臂的正確率降低(P<0.01)；與CPZ模型組比較，GB干預(yù)組在開臂所在時間百分比、進(jìn)入開臂次數(shù)、在開臂內(nèi)的總路程增加(P<0.05或P<0.01)，在水中不動時間減少(P<0.01)，游泳速度和距離升高(P<0.01)。

注：A：正常組；B：CPZ模型組；C：GB干預(yù)組圖1 各組小鼠腦胼胝體髓鞘脫失情況比較(LFB染色，比例尺=200 μm)

2.2 各組小鼠腦組織髓鞘脫失情況與正常組比較，CPZ模型組小鼠腦胼胝體髓鞘染色減少(P<0.01)；與CPZ模型組比較，GB干預(yù)組小鼠髓鞘染色增多(P<0.01)。結(jié)果見圖1、表2。

表2 各組小鼠大腦胼胝體髓鞘LFB染色及腦小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)比較

2.3 各組小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞比較結(jié)果見圖2、表2。與正常組比較，CPZ模型組腦皮層、胼胝體和紋狀體小膠質(zhì)細(xì)胞增多(均P<0.01)；與CPZ模型組比較，GB干預(yù)組腦小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少(均P<0.01)。

圖2 各組小鼠大腦不同部位小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況(免疫熒光染色，比例尺=100 μm)

2.4 各組小鼠腦組織Iba-1蛋白表達(dá)與正常組比較，CPZ模型組腦勻漿Iba-1蛋白表達(dá)升高 (P<0.01)；與CPZ模型組比較，GB干預(yù)組腦Iba-1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，結(jié)果見圖3、表3。

表3 各組小鼠大腦Iba-1蛋白相對表達(dá)水平及炎性因子表達(dá)水平比較

注：Iba-1：鈣離子結(jié)合銜接分子1圖3 各組小鼠腦組織Iba-1蛋白表達(dá)電泳圖(Western blot)

2.5 各組小鼠腦組織炎性細(xì)胞因子表達(dá)與正常組比較，CPZ模型組腦炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高(均P<0.01)；與CPZ模型組比較，GB干預(yù)組腦炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低(均P<0.01)。結(jié)果見表3。

2.6 各組BV2細(xì)胞上清液炎性細(xì)胞因子及NO表達(dá)與正常組細(xì)胞比較，模型組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β及NO水平高(均P<0.01)；與模型組細(xì)胞比較，GB干預(yù)組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β及NO水平低(均P<0.01)。結(jié)果見表4。

表4 各組BV-2細(xì)胞上清中炎性因子及NO表達(dá)比較

3 討論

GB具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用，可促進(jìn)腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，改善神經(jīng)功能[8]。GB通過調(diào)節(jié)鈣內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣釋放維持鈣穩(wěn)態(tài)，從而保護(hù)神經(jīng)元免受缺氧[9]。在大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型中，GB可通過激活蛋白激酶B(Akt)/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)通路保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷[10]。目前尚未檢索到有關(guān)口服GB是否具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘保護(hù)和再生作用的研究。

CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠常伴有焦慮、抑郁和認(rèn)知等行為障礙[11]。該研究結(jié)果顯示，CPZ喂食小鼠可出現(xiàn)焦慮、抑郁和認(rèn)知障礙，而口服GB可改善小鼠上述部分癥狀；與行為學(xué)改善結(jié)果一致，病理學(xué)染色顯示GB可有效改善髓鞘脫失，表明口服GB可能用于治療脫髓鞘病變。值得注意的是，本實(shí)驗中GB組的某些行為學(xué)指標(biāo)改善甚至好于正常對照組，但從病理形態(tài)學(xué)上其髓鞘脫失并未達(dá)到正常。作者推測其原因可能為：組織病理學(xué)觀察脫髓鞘反映疾病是一個相對客觀的指標(biāo)，受其他因素干擾較小，而焦慮、抑郁和認(rèn)知行為學(xué)指標(biāo)檢測受其他影響因素較多，如檢測時動物的狀態(tài)和情緒，可能造成行為學(xué)評分結(jié)果偏移真實(shí)的情況。因此，盡管GB組小鼠多數(shù)行為學(xué)評分“好于”正常對照組，但并不能得出GB干預(yù)可完全使小鼠恢復(fù)至正常狀態(tài)甚至比正常狀態(tài)更好的結(jié)論。

中樞脫髓鞘可導(dǎo)致繼發(fā)性小膠質(zhì)細(xì)胞活化及由此引起的神經(jīng)炎癥[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥不僅可直接靶向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，還可影響少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化成熟。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥，可改善腦內(nèi)微環(huán)境，清除受損及壞死的神經(jīng)組織，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，還能促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells，OPC)形成與分化，促進(jìn)髓鞘再生，改善神經(jīng)功能[13]。GB抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的可能機(jī)制為：首先，GB是一種PAF受體(platelet activating factor receptor，PAFR)拮抗劑[14]，可與血小板上的PAFR特異性競爭抑制，從而阻止PAF引起的血小板聚集。GB具有的特異性PAFR拮抗劑特征是確定PAF生物學(xué)作用和PAFR部位結(jié)構(gòu)性質(zhì)的有效工具，已被應(yīng)用于創(chuàng)傷性損傷和缺血再灌注模型等多種模型，至今為止是被評價最多的PAFR拮抗劑。其次，PAFR在不同腦區(qū)表達(dá)，包括下丘腦、大腦皮層、嗅球、海馬、腦干和脊髓。在細(xì)胞水平上，PAFR主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，即腦內(nèi)駐留的免疫細(xì)胞[15]。在創(chuàng)傷性腦損傷和缺血再灌注模型中，PAFR缺乏小鼠的腦損傷程度明顯小于野生型小鼠，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)前者的神經(jīng)炎癥也明顯低于后者[16-17]。盡管PAF-PAFR通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能尚未明確闡明，但已有證據(jù)表明PAF可通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化而誘導(dǎo)或增強(qiáng)神經(jīng)炎癥，從而以PAFR依賴的方式促進(jìn)疾病進(jìn)展和髓鞘脫失[15]。本研究結(jié)果顯示，GB可改善中樞脫髓鞘小鼠的行為障礙和髓鞘脫失，其作用機(jī)制極有可能與GB的PAFR拮抗劑作用有關(guān)，可能通過抑制PAF-PAFR通路發(fā)揮抑制小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥作用。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，口服GB可改善CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠的行為學(xué)障礙，減輕髓鞘損傷，其作用機(jī)制可能與其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)，從而改善炎癥微環(huán)境，發(fā)揮髓鞘保護(hù)作用。有關(guān)GB精準(zhǔn)的作用位點(diǎn)仍有待進(jìn)一步研究。