李增宏，廖烈強(qiáng)，周 舸，龐藝施，何子鍵，陳偉雄

（佛山市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科1，麻醉科2，廣東 佛山 528000）

喉惡性腫瘤（laryngeal cancer）是發(fā)病率僅次于口腔惡性腫瘤的最常見的頭頸惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率逐年上升[2]。超過90%的喉惡性腫瘤的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌[2]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及人民對(duì)生活質(zhì)量要求的不斷提高，喉癌的治療目標(biāo)已不僅僅在于保證生存率，喉功能的保留也日益受到關(guān)注[3]。鑒于此，提高喉癌的早期診斷率及探尋改進(jìn)喉癌的綜合治療策略，成為了業(yè)界的研究熱點(diǎn)。癌癥和腫瘤基因圖譜計(jì)劃（the cancer genome atlas，TCGA）的研究表明，人類乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）對(duì)于頭頸惡性腫瘤的分子信號(hào)通路具有決定性的調(diào)控作用[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，喉鱗狀細(xì)胞癌的HPV 感染率極低，提示針對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究更應(yīng)著重于HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)分子信號(hào)通路的研究?；|(zhì)金屬酶（matrix metallopeptidase，MMP）是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，可調(diào)控細(xì)胞基底膜的降解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移[6]。其中，MMP-9 參與降解細(xì)胞基底膜的主要成分——Ⅳ型膠原蛋白，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移尤其是上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7]。研究表明[8]，MMP-9 與喉癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而，目前尚未有研究指出MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及作用機(jī)制。本研究旨在探明MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌中的臨床表達(dá)特點(diǎn)，探討其應(yīng)用于早期診斷、預(yù)后評(píng)估及改善療效的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016 年1 月-2020 年12 月佛山市第一人民醫(yī)院收治的喉鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床數(shù)據(jù)及組織標(biāo)本，共計(jì)109 例。本研究已獲佛山市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患者均簽署同意書。上述病例均獲得病理證實(shí)，活檢前均未接受手術(shù)治療或放、化療等治療。獲得組織標(biāo)本后將其保存于-70 ℃超低溫冰箱中。

1.2 DNA 及RNA 提取 在低溫環(huán)境下將分別研磨喉癌腫瘤標(biāo)本及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織。研磨后一部分組織按照Promega 公司的Wizard?gnomic DNA purification kit 的說明書流程提取組織DNA。首先在研磨后的組織中加入細(xì)胞核裂解液及RNA 酶溶液混合，在37 ℃水浴中放置30 min。其后取上清液并加入100%異丙醇使DNA 沉降，并以70%的乙醇清洗2次以洗脫異丙醇。DNA 沉降物風(fēng)干后，加入DNA 水化溶液，放置于4 ℃冰箱過夜，制成DNA 溶液。剩余組織按照Invitrogen 公司的TRIZOL 的說明書流程提取組織RNA。首先在研磨后的組織中加入1 ml的TRIZOL 試劑，室溫下放置5 min。加入0.2 ml 氯仿至標(biāo)本混合液后搖勻，在37 ℃水浴中放置3 min，離心使混合液分層，取上清液與0.5 ml 異丙醇混合，在室溫下放置10 min，離心獲得RNA 沉淀，以1 ml的75%乙醇洗滌2 次。風(fēng)干RNA 沉淀后以無核酸酶水重新溶解制成RNA 溶液。提取所得的組織DNA及RNA 標(biāo)本存放于-70 ℃超低溫冰箱中。

1.3 HPV DNA 檢測 按照Qiagen 公司的Digene HC2 HPV DNA test 試劑盒的說明書流程檢測組織標(biāo)本中的HPV DNA[9]。配平組織標(biāo)本DNA 濃度后，將標(biāo)本DNA 樣本分別加入96 孔板的微孔中，加入HPV 特異性探針試劑與樣本混合，利用DML2000型二甘醇微板光度計(jì)讀取樣本的HPV DNA 的相對(duì)熒光信號(hào)值（relative light units，RLUs），并與生產(chǎn)商提供的陽性對(duì)照標(biāo)志物的RLU 值進(jìn)行比較。當(dāng)標(biāo)本的RLU 值高于陽性對(duì)照標(biāo)志物的RLU 值時(shí)，標(biāo)本被定義為“HPV 陽性”；當(dāng)標(biāo)本的RLU 值低于陽性對(duì)照標(biāo)志物的RLU 值時(shí)，則被定義為“HPV 陰性”。

1.4 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR 檢測 配平組織標(biāo)本RNA 濃度后，按照Life technologies 公司的High-Capacity cDNA conversion kit 的說明書流程，將組織樣本的RNA 中加入隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶、四種三磷酸脫氧核苷、RNA 酶抑制劑，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用Roche 公司的LightCycler?480 對(duì)cDNA 進(jìn)行RT-PCR 檢測。反應(yīng)程序：第一階段：95 ℃10 min；第二階段：95 ℃15 s 后60 ℃1 min，共45輪。以GAPDH 作為內(nèi)參基因，計(jì)算MMP-9 cDNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 觀察指標(biāo) 分析HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌中MMP-9 的表達(dá)特點(diǎn)，腫瘤組織及癌旁正常組織中MMP-9 的表達(dá)差異，比較MMP-9 表達(dá)與患者吸煙、飲酒、TNM 分期的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 16.0 軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用（n，%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；利用Wilcoxon Signed Rank test 分析腫瘤組織及癌旁正常組織中MMP-9 的表達(dá)差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料及HPV 感染狀況 患者大多為男性，長期吸煙史者較多，聲門型癌占比較高，其次為聲門上型癌，未見聲門下型癌病例，病例以T3、T4期為主，患者均呈HPV 陰性，見表1。

表1 患者臨床資料及HPV 感染狀況[n=109，n（%）]

2.2 MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況109 例患者中，55 例患者M(jìn)MP-9 呈高表達(dá)，54 例為低表達(dá)，其中不同年齡、吸煙、飲酒狀況及臨床分期的HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌患者M(jìn)MP-9 表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌的MMP-9 表達(dá)高于無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2；MMP-9 在腫瘤組織中的表達(dá)與癌旁正常組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 MMP-9 在HPV 陰性鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

表2 MMP-9 在HPV 陰性鱗狀細(xì)胞癌中的臨床特點(diǎn)[n（%）]

表2 （續(xù)）

3 討論

HPV 感染已被證明是頭頸鱗狀細(xì)胞癌的重要致病因素[10]。TCGA 研究表明[4]，在HPV 陽性頭頸惡性腫瘤及HPV 陰性頭頸惡性腫瘤之間，腫瘤信號(hào)調(diào)控通路具有明顯差異。相較于HPV 陽性的頭頸惡性腫瘤，HPV 陰性的頭頸惡性腫瘤對(duì)放化療的敏感度更低，預(yù)后更差[11]。本研究針對(duì)HPV 陰性喉癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制進(jìn)行研究，以期為喉癌尤其是HPV 陰性喉癌的早期診斷及精準(zhǔn)治療提供理論基礎(chǔ)。在眾多腫瘤信號(hào)調(diào)控通路中，EMT 相關(guān)通路對(duì)腫瘤惡性程度具有決定性作用[12]，并與腫瘤復(fù)發(fā)、放化療抵抗等密切相關(guān)[13，14]。鑒于此，對(duì)HPV 陰性喉癌的EMT相關(guān)通路上的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，對(duì)于改善喉癌的預(yù)后具有重大意義。

MMP-9 屬于Ⅳ型基質(zhì)金屬酶，通常以無活性的前體存在于體內(nèi)，被激活后可分解細(xì)胞基底膜的主要成分——Ⅳ型膠原蛋白以及明膠、層粘連蛋白、彈性纖維蛋白、原纖維蛋白、聚蛋白多糖等，使腫瘤細(xì)胞突破基底膜屏障，進(jìn)入血液及淋巴循環(huán)系統(tǒng)，并重塑腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞完成侵襲、遷移[15]。研究表明，MMP-9 的高表達(dá)在早期喉癌便可測得[16]，并與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)[17]，在喉癌的EMT 相關(guān)通路中扮演關(guān)鍵角色[8]，且與喉癌患者的5 年生存率呈負(fù)相關(guān)[18]。然而，目前尚無研究指出MMP-9 在HPV 陰性惡性腫瘤中扮演的角色。本研究結(jié)果顯示，MMqP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)。結(jié)合MMP-9 的高表達(dá)可在喉癌早期便可測得這一特點(diǎn)，MMP-9 有望作為HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷標(biāo)志物。另外，MMP-9 的高表達(dá)與HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號(hào)通路尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)通路中扮演重要角色。研究表明，MMP-9 高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的放化療抵抗密切相關(guān)[19-21]。有鑒于此，下調(diào)MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)，有望顯著抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，上調(diào)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。另一方面，MMP-9 抑制劑，包括巴馬司他、馬力馬司他、MMI270/CGS-27023A、GM6001、GI129471、CGS-25966、普馬司他、利巴馬斯他、鹽酸強(qiáng)力霉素、米諾環(huán)素及阿奇霉素已應(yīng)用于惡性腫瘤的治療中[22，23]，目前已處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)。上述MMP-9 抑制劑也有望應(yīng)用于HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌的治療中。

本研究報(bào)道了HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌中MMP-9 的表達(dá)特點(diǎn)，但仍有一定的局限性：本研究共計(jì)收集109 例病例，標(biāo)本量充足。但有腫瘤頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例為28 例，樣本量較少，對(duì)研究結(jié)果的精確性可能存在影響。未來仍需進(jìn)行更大規(guī)模的有腫瘤頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌的MMP-9 表達(dá)量的檢測。

綜上所述，通過調(diào)控MMP-9 相關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移通路，有望提高HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌放化療治療的療效，極有可能改善喉癌患者的預(yù)后。未來將開展進(jìn)一步研究，探明MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制，為喉癌的精準(zhǔn)診治、新型治療提供理論基礎(chǔ)及新的方向。