李添，李肖，田俊生，高曉霞，秦雪梅，周玉枝

(山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006)

抑郁癥作為一種常見的精神類疾病，以情緒低落、思維遲緩為臨床表現(xiàn)，重度抑郁還會出現(xiàn)失眠，幻覺甚至有自殺行為。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)通過溫和且不可預(yù)測的模仿引起人類壓力應(yīng)激源來誘發(fā)動物產(chǎn)生抑郁行為，與人類抑郁癥的發(fā)生及發(fā)展機制更接近，是目前藥理實驗中常見的抑郁模型之一[1]?，F(xiàn)代研究針對該模型的研究主要集中在海馬、額葉皮質(zhì)和紋狀體等中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2-3]，而其對肝組織的研究也必不可少。中醫(yī)理論認為治療抑郁癥應(yīng)當從疏肝解郁入手，肝主疏泄且肝臟是調(diào)節(jié)情志的主要器官，肝氣順，則人體的氣血運行通暢；肝氣郁結(jié)，人體氣血受阻[4]。因此，深入探索抑郁癥對肝臟組織產(chǎn)生的影響對于解釋抑郁癥的發(fā)病機理至關(guān)重要。

白芍是毛茛科白芍屬植物，酸寒收斂，養(yǎng)血柔肝，常與其他藥味共同組成疏肝解郁復(fù)方。賀妮等[5]證明白芍提取物對抑郁癥有較好的改善作用，可能是通過作用于單胺遞質(zhì)系統(tǒng)抑制炎癥因子相關(guān)靶點而產(chǎn)生抗抑郁和抗炎作用。白芍的主要化學(xué)成分包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等，王景霞等[6]發(fā)現(xiàn)白芍提取物(芍藥苷48.89 %和芍藥內(nèi)酯苷18.99 %)具有抗抑郁作用，對中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有調(diào)節(jié)作用并能明顯改善嗅球損毀大鼠的行為活動。然而，關(guān)于白芍是否通過調(diào)節(jié)CUMS大鼠的肝組織代謝輪廓從而發(fā)揮抗抑郁作用尚沒有文獻研究。

基于核磁共振技術(shù)的代謝組學(xué)，可利用動植物樣本的核磁共振譜圖，充分展示小分子代謝物的信息，通過對這些信息多元統(tǒng)計分析和模式識別處理[7]，了解相關(guān)代謝物的動態(tài)變化并揭示它們對于機體整體的生物學(xué)意義。在對抑郁癥CUMS模型的研究中，相比于抑郁樣行為學(xué)分析，代謝組學(xué)技術(shù)更能反映內(nèi)在機制[8-9]。因此本文通過行為學(xué)指標結(jié)合1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)來綜合評價白芍對CUMS大鼠肝臟代謝輪廓的調(diào)節(jié)作用，從而揭示其抗抑郁的作用機理,實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程圖

1 材料

1.1 試劑與儀器

蔗糖(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DHG-9050B恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實驗設(shè)備有限公司)；RV 10 digital V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國艾卡集團)；BRUKER 600 MHz AVANCE III超導(dǎo)核磁共振波譜儀(瑞士)；TGL-16高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 實驗藥品

白芍(批號：1710436111，產(chǎn)地：安徽)藥材飲片購于河北安國市祁澳中藥飲片有限公司；鹽酸文拉法辛膠囊(規(guī)格：25 mg/粒，批號：130101，廠家：成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司)。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200 ± 20)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～24 ℃，室內(nèi)相對濕度45%～55%，明暗交替周期12 h。動物實驗獲得山西大學(xué)倫理委員會的批準(批準號：SXULL2016036)。

1.4 白芍提取制備

稱取適量白芍藥材飲片，用8倍量70%乙醇浸泡1 h后回流提取2次，每次2 h，合并提取液，靜置、過濾、旋轉(zhuǎn)濃縮、冷凍干燥，制成細粉，儲存于-20 ℃冰箱備用。藥物使用前用蒸餾水超聲溶解為溶液。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

按照體質(zhì)量、曠場實驗、糖水偏愛實驗結(jié)果，選擇指標相近的大鼠60只，將其隨機分為空白組，模型組，陽性藥組(文拉法辛，35 mg·kg-1)，白芍低、高劑量組(生藥量15、30 g·kg-1)，給藥組按照大鼠體質(zhì)量10 mL·kg-1灌胃給藥，空白、模型組給予同等量的蒸餾水。

2.2 CUMS抑郁模型的復(fù)制

動物適應(yīng)7 d后，空白組大鼠正常飼養(yǎng)，不進行任何刺激，其余各組大鼠裝入單籠喂養(yǎng)，并按照前期實驗室建立的建模程序重建慢性不可預(yù)測的輕度應(yīng)激(CUMS)模型。為了確保刺激因素的不可預(yù)測性，隨機安排每日刺激，并保證各項刺激不連續(xù)出現(xiàn)，且發(fā)生的總數(shù)不應(yīng)超過4次，該過程持續(xù)28 d[10]，包括：禁水、禁食(各24 h)；熱刺激10 min；超聲刺激(60 W，3 h)；足底電擊(持續(xù)2 s，間隔10 s，共10次)；冰水游泳(4 ℃，高50 cm，直徑20 cm有機玻璃缸)；晝夜顛倒；束縛3 h。

2.3 行為學(xué)測試

2.3.1 體質(zhì)量

在實驗的第0、1、2、3、4周對大鼠進行稱量。

2.3.2 曠場測試(OFT)

納入標準:(1)所有患者均符合臨床關(guān)于白內(nèi)障的診斷標準,經(jīng)眼壓檢查、房角檢查或B超檢查確診;(2)年齡>60歲;(3)患者意識清晰、交流能力正常;(4)知曉實驗?zāi)康?簽署《知情同意書》。

利用曠場實驗[11]評估大鼠的運動和空間探索能力，在實驗開始的第0、1、2、3、4周進行。實驗裝置由100 cm2(25個相等正方形)的黑色區(qū)域組成，周圍是高40 cm的黑色墻壁。將大鼠緩慢地放到裝置的中心，適應(yīng)1 min，探索4 min，觀察測試期間每只大鼠的穿越橫格數(shù)雙肢離開地面1 cm的直立次數(shù)。每次測試后，用10%的酒精清洗曠場設(shè)備，以消除殘留的氣味。

2.3.3 糖水偏愛實驗(SPT)

根據(jù)文獻[11]報道，在第0和28天進行糖水偏愛測試。實驗前，將大鼠單獨飼養(yǎng)，并提供兩瓶1%的蔗糖水以適應(yīng)蔗糖溶液。在最初的24 h內(nèi)放入兩瓶1%的蔗糖水，在接下來的24 h，用日常飲用水替換其中一瓶1%的蔗糖水。經(jīng)過上述糖水偏愛率訓(xùn)練后，所有動物被剝奪食物和水12 h，然后大鼠自由選擇飲用蔗糖水或水12 h。根據(jù)消耗量計算出大鼠的糖水偏愛率糖水偏愛率(%)=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+飲用水消耗量)×100%。

2.3.4 強迫游泳實驗(FST)

參考前期文獻[11]，在測試前1天，將大鼠放入水深30 cm、溫度(25±1)℃的玻璃圓筒(直徑20 cm，高50 cm)中，進行15 min預(yù)測試以消除水引起的急性壓力。預(yù)測試24 h后，進行5 min的強迫游泳。不動時間被定義為當大鼠僅進行微妙的必要動作且其頭部保持在水上時狀態(tài)的時間。

2.4 肝組織樣本的收集

水合氯醛麻醉大鼠后進行腹主動脈取血，快速收集肝組織并立刻置于液氮中，并在-80 ℃冰箱冷凍保存以待進行核磁分析。

2.5 代謝組學(xué)樣品制備及測定

收集每只大鼠的肝臟外側(cè)葉組織約200 mg，加入600 μL甲醇，300 μL超純水于冰水浴中勻漿；在13 000 r/min和4 ℃下離心20 min，收集上清液，氮氣流吹干，于600 μL D2O磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH=7.4，含0.010 % TSP)中渦旋復(fù)溶后，在13 000 r/min和4 ℃下離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移到5 mm NMR管中用于分析。

2.6 1H-NMR譜圖數(shù)據(jù)處理與分析

1H-NMR圖譜處理使用MestReNova(6.1.1版，Mestrelab Research，Santiagode Compostella，西班牙)進行處理。對每張核磁圖譜進行相位和基線手動校正，以TSP的化學(xué)位移δ 0.00為標準，切除δ4.62～5.17區(qū)間的水峰，對δ0.75～8.56范圍的核磁圖譜以0.01為單位進行積分和總峰面積歸一化，產(chǎn)生數(shù)據(jù)矩陣。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將矩陣導(dǎo)入Excel表格中，采用SIMCA-P 13.0軟件(Umetrics公司，瑞典)進行主成分分析(PCA)觀察樣本整體分布情況，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)用于檢查各組之間的趨勢，并對建立的模型進行排列檢驗，排列檢驗是對R2(模型擬合度)和Q2(預(yù)測能力)的計算，V-S-plot圖結(jié)合VIP>1及t檢驗(P<0.05)作為篩選潛在生物標志物條件。使用生物學(xué)數(shù)據(jù)庫HMDB(http://www.hmdb.ca)進行代謝物的鑒定，并使用MetaboAnalyst網(wǎng)頁(https://www.metaboanalyst.ca/)進行代謝通路分析。SPSS 25.0軟件用于進行統(tǒng)計學(xué)分析，通過t檢驗比較兩組之間的統(tǒng)計學(xué)差異；one-way ANOVA比較多組之間的統(tǒng)計學(xué)差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 行為學(xué)測試

3.1.1 體質(zhì)量實驗

第4周模型組大鼠的體質(zhì)量顯著降低(P<0.001)，表明CUMS造模成功；給藥后，陽性藥組(P<0.01)、白芍低劑量組(P<0.001)的體質(zhì)量均發(fā)生顯著性增加(見表1)，表明白芍能有效逆轉(zhuǎn)CUMS造模引起的體質(zhì)量減輕。

3.1.2 曠場實驗

第4周模型組大鼠的穿越格數(shù)和直立次數(shù)都顯著減少(P<0.001，P<0.001)；給藥后，陽性藥組(P<0.001)、白芍低劑量組(P<0.01)的穿越格數(shù)均顯著增加(見表1)；陽性藥組(P<0.01)、白芍高低劑量組(P<0.05，P<0.05)的直立次數(shù)也有顯著增加(見表1)。結(jié)果表明，白芍能夠改善抑郁大鼠的曠場活動情況。

3.1.3 糖水偏愛實驗

第4周模型組大鼠糖水偏愛率顯著性減少(P<0.001)，給藥后，陽性藥組(P<0.001)、白芍低劑量組(P<0.05)的糖水偏愛率均顯著增加(見表1)。結(jié)果表明，白芍能顯著逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠的快感缺失現(xiàn)象。

3.1.4 強迫游泳實驗

第4周模型組大鼠強迫游泳不動時間顯著增加(P<0.001)。給藥后，陽性藥組(P<0.001)、白芍低劑量組(P<0.05)的不動時間均顯著減少(見表1)，結(jié)果說明白芍能有效逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠的行為絕望現(xiàn)象。

3.2 1H-NMR代謝組學(xué)

3.2.1 核磁圖譜歸屬

1H-NMR譜圖如圖2，結(jié)合文獻[12]報道和 HMDB(http://www.hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫對圖譜進行分析，共指認出42種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，結(jié)果如表2。

表1 第4周造模后大鼠行為學(xué)指標

表2 大鼠肝臟樣本1H-NMR數(shù)據(jù)歸屬

圖2 空白組大鼠肝臟樣本1H-NMR圖譜

3.2.2 多元統(tǒng)計分析

根據(jù)1H-NMR 圖譜成分歸屬獲得的肝臟內(nèi)源性代謝物信息，首先采用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)方法，從PCA得分圖及3D圖可以發(fā)現(xiàn)空白組和模型組能明顯分開(圖3A、3B)；為了驗證模型的可靠性，構(gòu)建PLS-DA模型圖(圖3C)，所有左側(cè)排列均低于右側(cè)原始值且相交于負半軸 (R2X=0.741、R2Y=0.987、Q2=0.947)，即為CUMS模型重建成功、可靠。進而采用有監(jiān)督的OPLS-DA，以篩選出與抑郁癥相關(guān)的差異變量。OPLS-DA得分圖顯示空白組和CUMS模型組可明顯分開(圖3D)，結(jié)合V-S-plot圖中VIP>1、P(corr)≥0.58且≤-0.58及t檢驗(P<0.05)篩選空白組與CUMS組的差異變量(圖3E)。對空白組、模型組、陽性藥組、白芍高、低劑量組進行OPLS-DA分析，可以看出各組間能清楚分離(圖3F)，說明各給藥組對篩選出的肝臟差異代謝物的調(diào)節(jié)程度不同。

注：A.空白組與模型組PCA得分圖；B.PCA-3D得分圖；C.PLS-DA模型驗證圖；D.OPLS-DA散點圖；E.V-S-plot圖；F.各組OPLS-DA散點圖圖3 多元統(tǒng)計分析圖

3.2.3 差異代謝物分析

由OPLS-DA分析結(jié)果篩選出24個與抑郁相關(guān)的生物標志物，相較于空白組大鼠，模型組大鼠肝臟中尿囊素、α-葡萄糖、β-葡萄糖、膽堿、甜菜堿、二甲基甘氨酸、甘油和氧化型谷胱甘肽8種代謝物含量升高；醋酸鹽、丙氨酸、肌酸、二甲胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、次黃嘌呤、異亮氨酸、亮氨酸、低密度脂蛋白、賴氨酸、丙酮酸、酪氨酸、鄰磷酸膽堿和纈氨酸16種代謝物含量降低。給藥后結(jié)果分析，白芍低劑量組能夠顯著回調(diào)與抑郁相關(guān)的全部差異代謝物，而白芍高劑量組能顯著回調(diào)其中除甘氨酸、鄰磷酸膽堿之外的22種代謝物。綜上可見，白芍高、低劑量組對肝臟中與抑郁相關(guān)的差異代謝物均有顯著回調(diào)作用。見圖4。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖4 各組大鼠肝臟差異代謝物的變化

3.2.4 代謝通路分析

將上述24種與抑郁癥相關(guān)的以及白芍能顯著回調(diào)的差異代謝物輸入metaboanalyst網(wǎng)頁中進行代謝通路分析。橫坐標Pathway impact表示代謝通路重要值，縱坐標-log(p)表示通路富集分析的P值水平。本研究以代謝通路重要值(impact value)>0.1以及代謝通路富集水平(-log p)>2作為篩選標準，篩選得到10條與抑郁相關(guān)的代謝通路(圖5)，分別為a：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝；b：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成；c：甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的代謝；d：丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝；e：丙酮酸代謝；f：酪氨酸代謝；g：谷胱甘肽代謝：h：糖酵解/糖異生；i：精氨酸的生物合成；j：乙醛酸酯和二羧酸酯代謝。代謝通路分析發(fā)現(xiàn)白芍能調(diào)節(jié)CUMS模型影響的10條代謝通路。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對與抑郁癥相關(guān)的10條代謝通路及所涉及的生物標志物進行關(guān)聯(lián)分析(圖6)，可見各代謝通路與生物標志物之間相互關(guān)聯(lián)，證明了抑郁癥發(fā)病機制的復(fù)雜性及白芍整體性調(diào)節(jié)的特點。

注：A.抑郁相關(guān)代謝通路；B.白芍調(diào)節(jié)代謝通路圖5 肝臟代謝通路的MetPA分析

注：空白組相比，紅色字體代表模型組上調(diào)的代謝物，藍色字體代表模型組下調(diào)的代謝物；與模型組相比，紅色箭頭代表白芍組代謝物顯著增加，藍色箭頭代表白芍組代謝物顯著減少。圖6 抑郁癥相關(guān)的10種代謝通路的代謝網(wǎng)絡(luò)

4 討論

白芍味苦、酸，性微寒，功能養(yǎng)肝血、補肝陰、抑肝陽，為養(yǎng)血柔肝，維持正常情志活動的要藥。四逆散、枳實芍藥散、柴胡疏肝散、逍遙散等歷代疏肝解郁的名方中，皆以白芍為主藥；現(xiàn)代中醫(yī)對于抑郁癥的臨床治療，無論在組方頻次和用藥劑量上，白芍也都占有重要的位置[6]。

本研究將CUMS模型大鼠視為研究對象，白芍給藥后，行為學(xué)指標得到顯著改善，表明白芍具有明確的抗抑郁藥效，運用核磁代謝組學(xué)技術(shù)鑒定出肝臟中24種與抑郁相關(guān)的差異代謝物，白芍干預(yù)后能回調(diào)全部的代謝物，代謝通路富集分析也表明白芍可以通過改善10條代謝通路發(fā)揮抗抑郁作用。其中谷氨酸作為一種已知的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其含量發(fā)生異常會誘發(fā)神經(jīng)毒性[13]。谷氨酸的生成途徑主要有兩條，分別是谷氨酰胺經(jīng)谷氨酰胺酶作用發(fā)生的轉(zhuǎn)化以及丙氨酸通過丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶發(fā)生的轉(zhuǎn)化，谷氨酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的肝臟谷氨酸含量顯著降低，代謝通路分析結(jié)果也表明CUMS造?？梢鸫笫蟾闻K中谷氨酸代謝發(fā)生紊亂，而白芍干預(yù)后都有所改善，表明白芍可改善谷氨酸在體內(nèi)的代謝紊亂情況，從而起到抗抑郁效果。

谷胱甘肽(GSH)是人體組織中含量最豐富的抗氧化劑，是抗氧化能力以及氧化應(yīng)激的關(guān)鍵指標，有研究表明，谷胱甘肽系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常會降低谷氨酸NMDA受體的谷氨酸能活性，減弱神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的產(chǎn)生，從而影響認知與情感[14]。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS 模型可引起大鼠體內(nèi)氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的升高，說明抑郁模型削弱了大鼠肝組織中抵御氧化應(yīng)激的能力，當給予抑郁大鼠白芍后，大鼠體內(nèi)GSSG的含量有所降低，提示白芍可以通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝增強體內(nèi)抗氧化能力發(fā)揮抗抑郁作用。

甘氨酸是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的競爭性配體，當甘氨酸結(jié)合到選擇性甘氨酸結(jié)合位點時，可間接增強NMDA 受體激動后所產(chǎn)生的生理效應(yīng)，而NMDA 受體的過度激活被認為是抑郁癥發(fā)生的重要原因之一[15]。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS 造模大鼠與正常大鼠相比，其肝臟中甘氨酸的含量顯著降低，白芍給藥后改善這一情況，可能與上述機理有關(guān)。

綜上所述，本研究從內(nèi)源性代謝物及代謝通路的角度，探索了白芍抗抑郁的作用機制，發(fā)現(xiàn)白芍對CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠發(fā)生的肝臟代謝紊亂有明顯改善作用，其發(fā)揮抗抑郁作用涉及多條代謝通路，但各差異性代謝物與抑郁癥的內(nèi)在聯(lián)系以及相關(guān)代謝通路的驗證仍需要進一步考察。