孫延平,王博譞,劉艷,梁軍,劉艷鑫,曹琦,楊炳友,王秋紅,匡海學(xué)*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所藥用資源開發(fā)實驗室，遼寧 大連 116023；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150081;4.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 512000)

牽牛子近年來研究文獻較少，大多主要集中于對牽牛子藥材本身的傳統(tǒng)功用、臨床應(yīng)用、毒副作用及部分藥理作用的總結(jié)歸納[1-5]，對于牽牛子的化學(xué)成分研究，近期僅限于對牽牛子苷類(樹脂苷類)成分的結(jié)構(gòu)研究[6]，以及牽牛子苷對抗癲癇、抗結(jié)腸癌、抗菌作用及機制研究[7-9]。目前對于牽牛子中大分子物質(zhì)的研究，特別是多糖類成分研究較少，本課題組前期從中藥藥性理論的角度進行了牽牛子化學(xué)拆分組分的性味藥理學(xué)評價及藥味歸屬研究，發(fā)現(xiàn)PNP具有利尿、增加大鼠大腸推進率及化痰等藥理作用[10]，此外，PNP通過降低炎性因子含量，提高腎小球過濾功能，顯著改善大鼠腎病綜合征,緩解水腫[11-12]。

多糖作為一種中藥中廣泛存在的大分子類化合物，具有復(fù)雜而多方面的生物活性和功能[13-17]，為了合理開發(fā)利用PNP這種豐富資源，多糖的結(jié)構(gòu)表征及其潛在活性急需挖掘。因此，本研究從PNP中分離純化得到均一多糖PNP-5，采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、高效凝膠排阻色譜(HPSEC)、高效液相色譜(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、高碘酸氧化Smith降解和甲基化分析、核磁共振(NMR)等技術(shù)從純度、分子量、基團特征結(jié)構(gòu)、單糖組成、主鏈側(cè)鏈糖苷鍵連接方式和組成對PNP-5進行結(jié)構(gòu)表征，并對其體外清除自由基活性及對體外小鼠脾細胞增殖活性進行了研究，以期為PNP的生物活性、作用機制和綜合利用提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 儀器與材料

R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；小型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化公司)；Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Alltech ELSD-2000蒸發(fā)光檢測器(美國Alltech公司)；pH計Sartorius PB-20(德國Sartorius公司)；Shimadzu FTIR-8400S紅外光譜儀(日本Shimadzu公司)；Shimadzu UV-1601紫外光譜儀(日本Shimadzu公司)；Thermo Fisher Scientific DSQ II氣相色譜質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)。

弱陰性陰離子交換樹脂F(xiàn)PA90Cl-(美國Amberlite公司)；弱陽性陽離子交換樹脂IRC84(美國Amberlite公司)；離子交換纖維素DEAE Cellulose 52(英國Whatman公司)；離子交換瓊脂糖凝膠DEAE-Sepharose F.F(瑞典Pharmacia公司)；丙烯葡聚糖凝膠Sephacyrl S-400(瑞典Pharmacia公司)；葡聚糖凝膠Sephadex G-50(瑞典Pharmacia公司)；糖柱Shodex sugar KS-805(日本Shodex公司)；標準葡聚糖Dextran(瑞典Pharmacia公司)；透析袋(截留分子量3500)(美國Sigma公司)；C.M.C[1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺對甲苯黃酸鹽](美國Fluka公司)；硼氫化鈉(美國Sigma公司)；三氟乙酸(德國Merck公司)；硫酸(北京市化學(xué)試劑公司)；氫氧化鈉(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)；重水D2O(瑞典Pharmacia公司)。

小鼠脾細胞來源BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，并于SPF級動物實驗室飼養(yǎng)。

牽牛子藥材于2012年10月購自于哈爾濱市藥材公司，產(chǎn)地為山東，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定，為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitisnil(L.)Choisy的干燥成熟種子，標本保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)實驗室。

2 方法

2.1 PNP-5的提取分離制備

將1 kg干燥的牽牛子用95%乙醇加熱回流提取，過濾，藥渣用水煎煮冷卻后濾過、合并濾液。加入95%乙醇使乙醇終濃度為85%，收集沉淀，冷凍干燥，得182 g牽牛子粗多糖。20 g 牽牛子粗多糖加入蒸餾水，使溶解成終濃度為5%的溶液，經(jīng)過Amberlite FPA90-Cl-(5 cm×50 cm)+Amberlite IRC-84(5 cm×50 cm)陰陽離子串聯(lián)樹脂柱，得到水洗脫部位，再經(jīng)DEAE-Cellulose DE-52(3.5 cm×50 cm)0.4 mol/L NaCl水溶液洗脫和Sephacryl S-400(1.6 cm×75 cm)凝膠色譜柱水洗脫，進一步分離純化，得到282 mg牽牛子均一多糖，并命名為PNP-5(Pharbitis nil polysaccharide-5)。

2.2 PNP-5結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 UV光譜測試

將PNP-5以蒸餾水配成濃度為2.0 mg/mL的溶液，離心，取上清液在190～400 nm內(nèi)利用紫外分光光度計進行掃描，以確定牽牛子多糖中是否含有核酸和蛋白質(zhì)綴合物。

2.2.2 純度檢驗及相對分子質(zhì)量測定

采用Waters高效液相色譜系統(tǒng)(2996泵，Alltech ELSD2000，Shodex sugar KS-805+保護柱KS-G)進行HPSEC法測試，室溫下以超純水為流動相，流速為0.5 mL/min。標準葡聚糖Dextran T10、Dextran T40、Dextran T70、Dextran T500、Dextran T2000作為標準品配置溶液進樣，以分子量的lg值為橫坐標，以保留時間tR為縱坐標作標準曲線，求得標準曲線的回歸方程。PNP-5樣品同法制備，進樣。根據(jù)保留時間，根據(jù)標準曲線回歸方程計算PNP-5分子量。

2.2.3 IR光譜測試

取2 mg PNP-5多糖樣品，用KBr壓片后進行常規(guī)IR掃描，掃描波長400～4 000 cm-1；對甲基化多糖樣品，則采用氯仿液膜的形式進行IR光譜掃描。

2.2.4 單糖組成的測定

稱取10 mg PNP-5樣品用2 mol/L三氟乙酸(TFA)溶液110 ℃水解8 h，經(jīng)離心分離取上清液，用甲醇反復(fù)減壓回收除去TFA至pH值為7.0，用去離子水定容至2.0 mL，離心，取上清液進行PMP衍生化，經(jīng)HPLC分析，在與以上相同條件下，以8種單糖：甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)作為對照品溶液制作峰面積與濃度的標準曲線回歸方程，根據(jù)各單糖對照品的保留時間，確定牽牛子多糖的單糖組成。

具體色譜條件采用Diamonsil?C18(2)色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)。流動相A：0.05 mol/L磷酸鹽(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)緩沖液-乙腈(體積比為85∶15)；流動相B：0.05 mol/L磷酸鹽(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)緩沖液-乙腈(體積比為60∶40)。梯度洗脫條件：時間為0→10→30 min，對應(yīng)流動相為100%→92%→80%溶劑A。紫外檢測波長為250 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣體積為10 μL。

2.2.5 高碘酸氧化Smith降解

依據(jù)文獻[18]方法進行高碘酸氧化反應(yīng)，最終計算出高碘酸的消耗量和甲酸的生成量。然后進行Smith降解反應(yīng)，將乙二醇處理后的溶液透析，取透析袋內(nèi)液濃縮，加入NaBH4還原過夜。用50%HAc中和至pH為6～7，蒸餾水透析。取1/3干燥后做GC分析，剩余部分進行Smith降解。加入等體積的1 mol/L H2SO4，25 ℃水解40 h，BaCO3中和至pH為6，用定量濾紙過濾，濾液用蒸餾水透析，袋外部分干燥做GC分析，袋內(nèi)加乙醇醇析，離心，上清及沉淀部分干燥后分別做GC分析。

2.2.6 甲基化分析

參考文獻方法[19-20]，取20 mg PNP-5進行甲基化，經(jīng)氯仿反復(fù)萃取后，IR圖譜在3 400 cm-1處無吸收峰，即無羥基吸收峰，則證明多糖甲基化完全。再經(jīng)水解、還原、乙酰化，進行GC-MS分析。

GC-MS分析條件：采用Agilent 5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，配備DB-1701毛細管柱，60 m×0.25 mm×0.25 μm，程序升溫，柱溫80 ℃，保持1 min，以5 ℃/min至200 ℃，以2 ℃/min至220 ℃，以10 ℃/min至270 ℃，保持1 min，氦氣作載氣，進樣口溫度250 ℃，分流比1∶42，柱流速1.2 mL/min。EI(70 eV)，接口溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，掃描范圍：m/z43～500，掃描速率：2.5 scan/s。

2.2.7 磁共振光譜分析

取PNP-5樣品40～60 mg溶于1 mL D2O，凍干后再次溶解于2 mL D2O，離心，上清液裝入核磁管，于室溫核磁共振儀上進行13C-NMR光譜測定。

2.3 體外生物活性研究

2.3.1 PNP-5體外清除ABTS+·活性測定

體外抗氧化活性采用簡單方便快速的體外抗ABTS+·自由基實驗，測定步驟如下：首先將ABTS溶于0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)溶液中，配成濃度為7 mol/L的溶液。然后，將7 mol/L的ABTS溶液加入過硫酸鉀使之終濃度為2.45 mol/L，即可配制成ABTS+·,混合溶液黑暗中靜置16 h開始使用。ABTS+·溶液用PBS溶液稀釋至吸光度為0.70±0.02(734 nm)，水浴30℃平衡30 min。把PNP-5樣品稀釋成濃度為0.078，0.156，0.312，0.625，1.25，2.5和5 mg/mL，各0.2 mL，加入2.0 mL稀釋好的ABTS+·溶液。在室溫下反應(yīng)20 min后，在波長為734 nm下，迅速測定并記錄吸光度。維生素C(Vc)作為標準對照品。ABTS自由基清除率百分比計算，根據(jù)公式如下：ABTS清除率(%)=[A0-(As-Ab)]/A0×100。其中A0為ABTS未加入樣品的A734；As為ABTS加入樣品的A734；Ab為樣品未加入ABTS的A734。

2.3.2 PNP-5體外對小鼠脾細胞增殖活性的影響

準確稱取PNP-5樣品1～2 mg，溶于適量生理鹽水，濃度為4 mg/mL。使用前分別取適量上述多糖溶液稀釋至濃度為5 μg/mL、25 μg/mL和125 μg/mL。小鼠頸椎脫位處死，眼球放血，75%酒精消毒。無菌取脾，置于盛無菌PBS液的培養(yǎng)皿中，用注射器片芯研磨后過100目篩網(wǎng)，用PBS沖洗3次。用PBS液洗滌小鼠脾細胞2次，每次用量10 mL左右。后1 000 r/min離心10 min，棄上清。加10 mL 10% FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液，混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞，后調(diào)細胞濃度至1×108/mL。將PNP-5各個濃度100 μL/孔，均設(shè)6個復(fù)孔，100 μL/孔，加入96孔培養(yǎng)板中，以RPMI-1640對照。每孔加細胞懸液100 μL，置5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)44 h。每孔加入5 mg/mL MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入二甲亞砜100 μL，于微量振蕩器上緩慢作用10 min，在酶標儀上于492 nm處測吸光度值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果與討論

3.1 UV光譜分析

PNP-5凍干品為土黃色絮狀物，吸濕性強，能溶于水，易溶于熱水，不溶于有機溶劑。PNP-5的紫外光譜在260 nm和280 nm處無明顯吸收峰，表明無核酸和蛋白質(zhì)(圖1)。

圖1 PNP-5 UV光譜圖

3.2 純度檢驗及相對分子質(zhì)量測定

按tR-lgM關(guān)系作圖得到標準葡聚糖的分子量標準曲線，標準曲線的回歸方程為y=0.445 5x+14.146,R2=0.993 6。HPSEC法測定PNP-5凝膠曲線圖譜見圖2，顯示為單一對稱峰，表明PNP-5為均一性多糖。根據(jù)PNP-5的保留時間tR為17.721 min，計算出它們的分子量為1.78×106Da。

3.3 IR光譜分析

PNP-5的IR光譜顯示其具有多糖類物質(zhì)的特征吸收峰(圖3)，3 355 cm-1出現(xiàn)一種寬峰，為O-H的伸縮振動峰，表明多糖存在分子內(nèi)和分子間的氫鍵；2 931 cm-1處有吸收，為C-H的伸縮振動峰；1 647 cm-1處為糖類-OH吸收峰；1 600 cm-1、1 417 cm-1有吸收表明有羧酸離子存在；在1 400～1 410 cm-1處有吸收峰，可能為C-O伸縮振動引起的；在1 240～1 040 cm-1間有特征峰，可能為O-H變角振動引起的，1 147 cm-1、1 060 cm-1、1 041 cm-1處具有很強的糖環(huán)特征吸收，表明具有吡喃環(huán)特征結(jié)構(gòu)。

3.4 單糖組成分析

將PNP-5完全酸水解后，通過PMP柱前衍生，經(jīng)高效液相定量分析，見圖4，結(jié)果表明PNP-5的組成單糖為Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Xyl、Gal和Ara，其摩爾比為3.2∶10.6∶5.7∶1.5∶1.0∶4.5∶1.7∶4.5，相應(yīng)的摩爾百分數(shù)分別為9.9%、32.3%、17.4%、4.6%、3.1%、13.7%、5.3%和13.7%。以上數(shù)據(jù)表明，PNP-5為一個以鼠李糖為主的酸性雜多糖。

圖2 PNP-5的HPSEC色譜圖 (tR=17.721 min)

圖3 PNP-5的IR光譜圖

圖4 PNP-5經(jīng)完全酸水解后的PMP衍生物HPLC圖

3.5 高碘酸氧化Smith降解反應(yīng)分析

將PNP-5進行高碘酸氧化反應(yīng)，結(jié)果表明生成甲酸的鍵型占30.5%，說明每10個己糖殘基大約有3個非還原末端或1→6糖苷鍵，并且存在連三羥基，即存在1→或1→6鍵型；被高碘酸氧化但不產(chǎn)生甲酸的鍵型占52.1%，說明有約1/2的鍵型為1→2、1→2,6、1→4或1→4,6等鍵型；不被高碘酸氧化的鍵型占17.4%，說明還有少量的1→3，或1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6、1→2,3,4鍵型中的某些鍵型。

高碘酸氧化后進行完全酸水解，只檢出大量的Gly、Ery、Rha，此外還有少量的Gal，表明糖鏈中主要存在1→、1→6、1→2、1→2,6、1→4、1→4,6等鍵型中的某些鍵型，且Rha及Gal中含有某些不被高碘酸氧化的鍵型如1→3，或1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6、1→2,3,4等鍵型。經(jīng)Smith降解后，袋內(nèi)沉淀檢出Gly、Ery、Rha和Gal，表明主鏈核心部分含有1→、1→6、1→2、1→2,6、1→4、1→4,6中的某些鍵型，且Rha和Gal所含的1→3，或1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6、1→2,3,4鍵型中的某些鍵型存在于主鏈核心部分；袋內(nèi)上清部分只檢測出含有Ery，說明支鏈或主鏈邊緣只存在1→4或1→4,6鍵型；袋外部分只檢測出含有Gly，說明支鏈或者主鏈的末端殘基上含有1→、1→6、1→2、1→2,6中的某些鍵型(表1)。

表1 PNP-5經(jīng)高碘酸氧化Smith降解片段結(jié)果

3.6 甲基化分析

將PNP-5的甲基化產(chǎn)物，通過酸水解、乙?；苽涑善浒柕洗家宜狨ィ?jīng)過GC-MS分析，可以得到PNP-5中糖殘基的各種連接方式(表2)。其中阿拉伯糖基只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,3,5-tri-O-methyl-1,4-di-O-acetyl-arabinitol，表明阿拉伯糖以呋喃環(huán)的形式存在，其連接方式主要為T-Araf-(1→，約占13.7%；鼠李糖共表現(xiàn)出2種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即3,4,6-tri-O-methyl-1,2,5-tri-O-acetyl-rhamnitol、3,6-di-O-methyl-1,2,4,5-tetra-O-acetyl-rhamnitol，表明鼠李糖均以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式為→2)-Rhap-(1→和→2,4)-Rhap-(1→，其中以→2)-Rhap-(1→為主，約占20.2%；甘露糖只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,3-di-O-methyl-1,4,5,6-tetra-O-acetyl-mannitol，表明甘露糖以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式為→4,6)-Manp-(1→，約占9.9%；木糖只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,3,4,6-tetra-O-methyl-1,5-di-O-acetyl-xylitol，表明木糖以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式為T-Xylp-(1→，約占13.7%；葡萄糖只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,3,4-tri-O-methyl-1,5,6-tri-O-acetyl-glucitol，表明葡萄糖以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式主要為→6)-Glcp-(1→，約占3.1%；半乳糖只表現(xiàn)出1種阿爾迪醇乙酸酯衍生物，即2,4-di-O-methyl-1,3,5,6-tetra-O-acetyl-galactitol，表明半乳糖以吡喃環(huán)的形式存在，其連接方式主要為→3,6)-Galp-(1→，約占5.3%；糖醛酸主要表現(xiàn)為→4)-GalpA-(1→和→4)-GlcpA-(1→，其分別約占4.6%和17.4%。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺對甲苯黃酸鹽(CMC)還原后的CMC-PNP-5色譜圖較還原前的PNP-5多檢測出2,3,6-tri-O-methyl-1,4,5-tri-O-acetylgalactitol和2,3,6-tri-O-methyl-1,4,5-tri-O-acetylglucitol，因此確定了PNP-5中糖醛酸的連接方式。

表2 PNP-5的糖連接方式分析

3.7 核磁譜分析

PNP-5的13C-NMR譜(圖5)中，在δ54.6處的碳信號，可歸屬于糖醛酸甲酯化后的甲氧基碳信號。δ16.5～17.8處的碳信號，為鼠李糖碳6上的碳信號。δ20～24范圍內(nèi)出現(xiàn)的甲基信號證明存在氨基糖。在糖殘基端基碳信號區(qū)，δ103.7處的碳信號，可歸屬于α-D-Araf、(1→2,4)-α-Rhap、(1→4,6)-β-D-Manp、β-D-Xylp、(1→4)-α-GlcpA端基碳信號；δ97.9處的寬單峰碳信號，可歸屬于(1→2)-α-Rhap端基碳信號。

圖5 PNP-5的13C-NMR譜

3.8 PNP-5體外清除ABTS+·活性

表3為Vc、PNP-5對ABTS自由基的清除率數(shù)據(jù)。從數(shù)據(jù)可以看出，PNP-5具有明顯的量效關(guān)系，呈現(xiàn)出劑量依賴性，并具有良好的自由基清除能力。在濃度為0.078125 mg/mL時，Vc、PNP-5樣品ABTS自由基清除率差別不顯著。在濃度為1.25 mg/mL時，清除率就可達到98.46%，PNP-5樣品在1.25～ 5mg/mL濃度時，ABTS自由基清除率均接近100%，并具有明顯的量效關(guān)系。通過計算IC50為0.339接近Vc的0.111，表明PNP-5對ABTS自由基的清除能力很強。

表3 PNP-5對ABTS自由基清除活性

3.9 PNP-5體外對小鼠脾細胞增殖活性的影響

由表4可知，PNP-5在5～125 μg/mL濃度范圍內(nèi)均對小鼠脾淋巴細胞增殖產(chǎn)生抑制作用，并且隨著劑量的增加，增殖指數(shù)逐漸降低。隨著劑量的增加，增殖指數(shù)逐漸降低，當(dāng)PNP-5濃度達到125 μg/mL時，小鼠脾細胞增殖指數(shù)為0.70±0.05，與空白組比較，具有極顯著差異(P<0.01)，此時對小鼠脾淋巴細胞增殖產(chǎn)生非常顯著的抑制作用。

表4 不同濃度PNP-5體外對小鼠脾細胞增殖指數(shù)影響

4 結(jié)論

綜合IR光譜、糖組成分析、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析及13C-NMR光譜等化學(xué)和波譜學(xué)方法，對PNP-5的結(jié)構(gòu)表征如下：PNP-5的單糖組成為Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Xyl、Gal、Ara，其摩爾百分數(shù)分別為9.9%、32.3%、17.4%、4.6%、3.1%、13.7%、5.3%、13.7%。可知PNP-5亦為一個以Rha為主的酸性雜多糖。其苷鍵構(gòu)型同時包含α和β兩種。PNP-5主鏈可能以Rha為核心連接少量的Glc、Gal和Man作為主鏈，支鏈部分主要包含GlcA、GalA。其中，這些醛酸是在Rha的C-4位有連接的分支點，在Gal的C-6位有連接的分支點，此外還在Man的C-6位有連接的分支點。PNP-5的末端殘基為α-Araf-(1→和β-D-Xylp-(1→。體外生物活性研究結(jié)果顯示，ABTS自由基清除率IC50值為0.339mg/mL，表明PNP-5具有很強的ABTS自由基清除能力。此外，PNP-5在5～125 μg/mL濃度時，具有明顯的體外抑制小鼠脾細胞增殖活性，且隨著劑量的增加，其抑制作用逐漸加強。