繆寶洲，汪敬恒，鐘俊峰，潘恩，林秀麗

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福鼎市醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，福建福鼎355200

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是ICU常見疾病，隨著生活方式的改變，發(fā)病日趨年輕化[1-2]。重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）患者伴有或者不伴有多臟器功能衰竭（mutiple organ failure,MOF），決定了其嚴(yán)重程度，尤其是急性肺損傷（acute lung injure,ALI）[3]和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）[4]。外泌體排出細(xì)胞外并攜帶核酸傳遞信息，可穿透血管壁，同時可穿透細(xì)胞外基質(zhì)[5]，其中MicroRNA即為外面運輸核酸之一，從而影響下游基因表達(dá)[6-7]。SAP-ALI的內(nèi)皮細(xì)胞通透性發(fā)生改變，可能導(dǎo)致外泌體的分泌增多，攜帶MicroRNA增多[8]。

AP發(fā)生發(fā)展過程中，胰液的釋放會導(dǎo)致胰腺自我消化[9]，從而產(chǎn)生IL-17的CD4+T輔助細(xì)胞（Th17）的積聚[10]。文獻(xiàn)中已經(jīng)證實SOCS1調(diào)節(jié)STAT5，STAT5是Treg細(xì)胞的統(tǒng)計調(diào)節(jié)器[11]。Wang等[12]人研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以抑制SOCS1，從而影響AP的發(fā)生發(fā)展過程。設(shè)想miR-155通過外泌體包裹轉(zhuǎn)運可以通過SOCS1影響SAP-ALI的過程。因此該文方便選取福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福鼎醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（ICU）2019年1—12月收治入院的128例急性胰腺炎患者血漿進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

方便選取福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福鼎醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（ICU）收治入院的128例急性胰腺炎患者血漿，其中急性胰腺炎伴肺損傷（AP with ALI,AWA）35例，急性胰腺炎不伴肺損傷（AP without ALI,AOA）93例，采集8名非患者志愿者血漿，年齡39~53歲。根據(jù)伴有或者不伴有ALI將患者分成兩組，AWA組35例，男女比例為17例∶18例，平均年齡為（48.6±16.1）歲；AOA組93例，男女比例為44例∶49例，平均年齡（45.6±16.5）歲。采集8名非患者志愿者血漿，平均年齡（46.3±4.17）歲。簽署知情同意書后，經(jīng)過福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福鼎醫(yī)院倫理委員會論證通過，倫理委員會批準(zhǔn)文號：鼎醫(yī)綜〔2020〕124號。外泌體大體試劑盒：德國QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集因胰腺炎急診入院的患者外周血3~5 mL，抗凝，至實驗室離心，低速1 000 g，10 min。取上層血漿至1.5 m LEP管，分裝做好標(biāo)記，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取外泌體將標(biāo)本從儲存管中取出，用200 mL XBP緩沖液與血漿等體積混合，收集混合液體，注入exoEasy濾柱中離心。使用PexoEasy濾柱加入緩沖液后離心。在濾網(wǎng)膜上，室溫孵育1 min。離心，5 000 g，5 min，備用。

1.2.3 提取RNA加入400 μl酸化酚氯仿，通過震蕩方式進(jìn)行混勻，時間30~60 s。混勻后加入20 μl外部參照cel-miR-39(5 pmol/L)。純乙醇萃取離心結(jié)束。洗滌，離心條件為室溫9 500 g，空轉(zhuǎn)1 min后棄去收集管，用新的收集管將洗脫液預(yù)熱至95℃。預(yù)熱好洗脫液后加入濾膜中，根據(jù)上述條件再離心30 s，回收收集管內(nèi)濾液。檢測收集到的溶液。

1.2.4 進(jìn)行miR-155的熒光定量檢測 以U6為內(nèi)參基因，U6及miR-155特 異 引 序 列 為，miR-155:Forward primer:5'-GCGAAAGCATTTGCCAAGAA-3'，Reverse primer:5'-CATCACAGACCTGTTATTGC-3'；內(nèi) 參U6:Forward primer:5'-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3'，Reverse primer:5'-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3'。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，PCR以celmiR-39作為外源性參照，miR-155相對表達(dá)量計算公式45-Ct=45-（CtmiR-155-CtmiR-39）。miR-155結(jié)果中，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)，取算術(shù)平均值。計量資料以（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定

Western blot結(jié)果提示，β-actin未在外泌體檢測出，外泌體未被污染；外泌體組，TSG101和CD81特異性標(biāo)志物表達(dá)升高，外泌體分離成功，見圖1A。用細(xì)胞攝取動態(tài)光散射分析，發(fā)現(xiàn)外泌體平均直徑為（80.69±18.11）nm，同時證實外泌體具有膜結(jié)構(gòu)呈囊泡狀，見圖1B。

圖1 外泌體鑒定：A.western blot結(jié)果顯示TSG101和CD81表達(dá)；B.外泌體的形態(tài)

2.2 3組血漿外泌體miR-155水平比較

AWA患者血漿外泌體miR-155的相對表達(dá)量為（15.11±2.18），AOA患者血漿外泌體miR-155的相對表達(dá)量為（10.64±1.65），非患者志愿者（NC）血漿外泌體miR-155的相對表達(dá)量為（5.19±0.44）。AOA組血漿外泌體miR-155水平顯著高于健康志愿者（P＜0.01）；AWA組血漿外泌體miR-155水平顯著高于AOA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 外泌體miR-155在AWA患者血漿中的表達(dá)情況

2.3 miR-155直接靶點SOCS1的確定

為了研究miR-155的潛在靶基因，利用targetscan軟件進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。使用這種方法，在3’-UTR的SOCS1 mRNA中預(yù)測miR-155結(jié)合位點，見圖3A。為了檢測miR-155對SOCS1的調(diào)節(jié)作用，對CD4+T細(xì)胞進(jìn)行了雙熒光素酶報告試驗。細(xì)胞共轉(zhuǎn)染了野生型（WT）或突變型（MUT）SOCS13’-UTR質(zhì)粒和miR-155或?qū)φ誱iR轉(zhuǎn)染。MiR-155顯著抑制WT的熒光素酶報告活性，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但不抑制MUT-SOCS13’-UTR，表明SOCS1是MiR-155的直接靶點（圖3B）。RT-PCR分析miR-155轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的SOCS1，證實miRNA下調(diào)了CD4+T細(xì)胞中SOCS1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3，用miR-155抑制劑處理細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)這種作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3C。

圖3 miR-155直接靶點SOCS1的確定。A.miR-155和SOCS1 mRNA的序列匹配；B.WT或MUT SOCS1 3’-UTR與miR-155或?qū)φ誱iR共轉(zhuǎn)染的熒光素酶檢測報告；C.轉(zhuǎn)染后3天CD4+T細(xì)胞SOCS1的Rt-PCR分析

2.4 3組血漿CD4+T細(xì)胞中SOCS1表達(dá)情況比較

為探討miR-155對AP和ALI的作用機(jī)制，進(jìn)一步研究了不同分組中CD4+T細(xì)胞的SOCS1的表達(dá)情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AWA組較AOA組，SOCS1在蛋白和mRNA水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。AOA組較正常組，SOCS1在蛋白和mRNA水平也均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 western blot實驗和實時定量PCR實驗

3 討論

目前AP的診斷包括兩個方面，臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，但尚無準(zhǔn)確預(yù)測AP嚴(yán)重程度的標(biāo)志物，此標(biāo)志物需要時間準(zhǔn)確性，即必須在早期發(fā)現(xiàn)并準(zhǔn)確預(yù)測。miR-155參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展[13]，在某些胰腺疾病中，如星狀細(xì)胞通過相關(guān)機(jī)制轉(zhuǎn)化時，miR-155表達(dá)下調(diào)[14]。該課題依據(jù)以上調(diào)查基礎(chǔ)，采集AP患者血漿并分離純化鑒定血漿外泌體，研究發(fā)現(xiàn)外泌體miR-155在AWA患者血漿中顯著高表達(dá)，AWA患者相對表達(dá)量為（15.11±2.18），AOA患者相對表達(dá)量為（10.64±1.65），NC組相對表達(dá)量為（5.19±0.44）。AWA組血漿外泌體miR-155水平是AOA組的1.5倍，是NC組的3倍，這從側(cè)面提示miR-155可能以外泌體形式存在于血漿中，并與AP的病情發(fā)展有一定的關(guān)系。Jiménez等[15]人發(fā)現(xiàn)，AP能夠產(chǎn)生2個不同的外泌體群，它們在細(xì)胞分布、蛋白質(zhì)和miRNA含量上存在相應(yīng)的差異，并且可以產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)。其中一個即miR-155明顯升高為特點，且miR-21和miR-122降低，其中AP組外泌體miR-155是對照組的4倍，而該文結(jié)果中AWA是NC組的3倍，結(jié)果相近，與該研究結(jié)果相符。說明外泌體miRNA的異常表達(dá)，會對疾病產(chǎn)生較大影響，結(jié)果顯示，miR-155在AWA患者血漿外泌體中高表達(dá)。

那么外泌體miR-155通過什么途徑對AP的嚴(yán)重程度發(fā)揮作用？有研究顯示，miR-155可通過靶向結(jié)合SOCS1發(fā)揮抗腫瘤作用，Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-155通過直接靶向SOCS1促進(jìn)間變性甲狀腺癌的進(jìn)展，其研究結(jié)果表明，熒光素酶實驗驗證了miR-155和SOCS1的靶向結(jié)合作用，同時能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞中SOCS1的表達(dá)，降低其表達(dá)后從而造成腫瘤進(jìn)展。該研究進(jìn)一步研究了miR-155與SOCS1的關(guān)系，利用targetscan軟件進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。使用這種方法，在3’-UTR的SOCS1 mRNA中預(yù)測miR-155結(jié)合位點（圖3A）。為了檢測miR-155對SOCS1的調(diào)節(jié)作用，對CD4+T細(xì)胞進(jìn)行了雙熒光素酶報告試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-155通過抑制性結(jié)合SOCS1 mRNA達(dá)到抑制其表達(dá)（圖3C），對照組明顯高于miR-155組，約為3倍，得到了與Zhang等人的研究類似的結(jié)果。同時進(jìn)行不同分組之間SOCS1的表達(dá)情況分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AWA組較AOA組，SOCS1在蛋白和mRNA水平均明顯降低（P＜0.05），如圖4所示。AOA組較NC組，SOCS1在蛋白和mRNA水平也均明顯降低（P＜0.05），與外泌體miR-155的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過以上結(jié)果，推論可以發(fā)現(xiàn)，SOCS1參與了AP的發(fā)生發(fā)展過程，外泌體miR-155通過抑制性結(jié)合SOCS1的3’TUR來抑制其表達(dá)，影響AP的病程進(jìn)展。在Wang等[12]的研究中，在胰腺炎中已經(jīng)證實miR-155可以靶向結(jié)合SOCS1并通過這一調(diào)節(jié)軸對Th17/Treg比率進(jìn)行調(diào)節(jié)，SOCS1的表達(dá)情況與胰腺炎的嚴(yán)重程度相關(guān)，與該研究結(jié)果一致。綜上所述，外泌體miR-155可以作為預(yù)測AP病程進(jìn)展的標(biāo)志物，值得進(jìn)一步深入研究。

外泌體miRNA在近些年研究中呈現(xiàn)明顯的應(yīng)用優(yōu)勢，尤其在重癥疾病中，包括胰腺炎、腫瘤、腎纖維化等方面。該研究確定了SOCS1是miR-155的直接靶向結(jié)合目標(biāo)，外泌體源性miR-155在AWA患者血漿中高表達(dá)，其可通過調(diào)節(jié)SOCS1的表達(dá)影響重癥急性胰腺炎肺損傷，為外泌體在重癥胰腺炎方面的研究打下基礎(chǔ)。但對其機(jī)制仍所知甚少，如外泌體源性miR-155如何發(fā)生上調(diào)，如何發(fā)生下調(diào)，是否可以確定界定值范圍，來判斷疾病進(jìn)展情況，需要繼續(xù)深入研究。

綜上所述，外泌體源性miR-155的表達(dá)水平與重癥胰腺炎患者的發(fā)病情況息息相關(guān)，使得它對于疾病的預(yù)后判斷十分重要，有望成為診斷和提示預(yù)后的生物標(biāo)志物。因此可進(jìn)一步對miR-200c的發(fā)展?jié)摿M(jìn)行挖掘，從而更好的為臨床服務(wù)。