劉云哲，王 琳，張喜悅，鄒 明，王君瑋，趙 格

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心致病微生物監(jiān)測室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（青島），山東青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

近年來，食品中微生物含量超標(biāo)導(dǎo)致的食源性致病微生物（主要指食源性致病菌）污染問題層出不窮。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）調(diào)研數(shù)據(jù)[1]顯示，全球每年因攝入被食源性致病菌污染的食物而罹患疾病的人數(shù)高達(dá)6 億，死亡人數(shù)約42 萬，死亡病例中5 歲以下兒童占比較高，達(dá)到了29.76%。在我國，每年約有1/6 的人因食用被食源性致病菌污染的食品而患病[2]。

美國疾病預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）相關(guān)調(diào)查[3]表明，近幾年美國沙門氏菌感染率日漸增長，在食源性致病菌中居于首位。據(jù)我國相關(guān)報(bào)道[4]，沙門氏菌是引發(fā)微生物性食源性疾病的首位致病菌，而豬肉是首位歸因食品。實(shí)際上，可引發(fā)食源性疾病的常見致病菌還有大腸桿菌、單增李斯特菌等。此外還可能存在一些未知病原，這些病原往往難以通過常規(guī)檢測手段鑒定，因而導(dǎo)致相關(guān)部門不能對(duì)即將暴發(fā)的食品安全事件迅速作出反應(yīng)。目前，諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等分子生物學(xué)技術(shù)往往只能針對(duì)純化后的某一種細(xì)菌的特征性靶點(diǎn)開展檢測[5]，而下一代測序技術(shù)在快速檢測食源性致病菌和預(yù)防食源性疫情傳播，尤其是在發(fā)現(xiàn)未知食源性病原體方面擁有巨大潛力[6]。因此，為更好地對(duì)食源性致病菌進(jìn)行監(jiān)測，采用更高效準(zhǔn)確、靈敏特異的微生物檢測技術(shù)變得尤為重要。

1 技術(shù)簡介

下一代測序技術(shù)是一次性可對(duì)幾十萬到幾億的DNA 分子進(jìn)行序列測定的高通量技術(shù)，正廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)相比，下一代測序技術(shù)操作過程已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化或者半自動(dòng)化，可以迅速精確地獲得樣品中的微生物基因組信息，且無需對(duì)樣品進(jìn)行前增菌培養(yǎng)便可對(duì)其中的多種微生物同時(shí)進(jìn)行分析。理想的下一代測序技術(shù)應(yīng)該具有迅速、準(zhǔn)確、花費(fèi)低且易操作等優(yōu)點(diǎn)[7]。

目前，下一代測序技術(shù)主要指二代測序和三代測序技術(shù)。二代測序技術(shù)因其高通量、高效率、高準(zhǔn)確性及低成本等優(yōu)勢(shì)逐漸普遍被應(yīng)用于不同領(lǐng)域[8-13]。微生物的全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）技術(shù)在二代測序中應(yīng)用較為廣泛，它能檢測樣品中各遺傳物質(zhì)的相關(guān)性，從而追溯疫病暴發(fā)源頭。2011 年，以PacBio等研發(fā)的SMRT 測序技術(shù)和Oxford 研發(fā)的Nanopore Technologies 為代表的三代測序技術(shù)應(yīng)時(shí)而生[14-16]。三代測序技術(shù)面世后，微生物的宏基因組測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）有了更好的發(fā)展，特別是二代測序和三代測序技術(shù)聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)了微生物宏基因組或者全基因組既高效又準(zhǔn)確的測序。mNGS的優(yōu)勢(shì)在于能發(fā)現(xiàn)新病原體和以前未發(fā)現(xiàn)的病原體，而且能在未找到導(dǎo)致疾病暴發(fā)病原體的前提下對(duì)疫情進(jìn)行初步診斷，這為及時(shí)檢測暴發(fā)疾病，開展溯源研究和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以及鑒定新的、難以發(fā)現(xiàn)的病原體提供了巨大幫助。

2 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

目前對(duì)于食品微生物檢測，傳統(tǒng)檢測方法主要是先對(duì)致病菌分離培養(yǎng)，然后再依據(jù)國標(biāo)GB 4789 系列的生化鑒定方法進(jìn)行鑒定[17]。傳統(tǒng)鑒定微生物分子分型技術(shù)包括擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）[20]、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）[21]、脈沖場凝膠電泳（PFGE）[22]、多位點(diǎn)序列分型（MLST）[23]、多位點(diǎn)可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)分析（MLVA）[24]等。這些常規(guī)技術(shù)常被用于食源性疾病暴發(fā)的病原基因型鑒定，很長一段時(shí)間里它們作為主要工具和金標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于食源性致病菌的監(jiān)測識(shí)別和溯源追蹤，但這些技術(shù)同樣普遍存在耗時(shí)長、檢測通量不高、準(zhǔn)確性較低等弊端，而且操作過程繁瑣[25-26]。

近些年發(fā)展起來的mNGS 技術(shù)，同樣可應(yīng)用于食源性致病菌檢測[18-19]。由于mNGS 技術(shù)可以針對(duì)采集的樣品一次性獲取所含有的微生物基因組和豐度信息，研究致病菌和樣本中其他菌類的相關(guān)性，特別是不會(huì)錯(cuò)過傳統(tǒng)培養(yǎng)難以獲得的微生物信息，因此具有巨大潛力。

目前PFGE 等技術(shù)分辨率有限，特別是在區(qū)分屬于同一細(xì)菌克隆的菌株時(shí)；而WGS 技術(shù)則可以準(zhǔn)確檢測難以培養(yǎng)的生物體，包括難以培養(yǎng)的細(xì)菌和厭氧菌[27]。此外WGS 技術(shù)可以取代目前基于PCR 的毒素檢測，如最近對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測證明[28]，WGS 抗菌表型和基因型表現(xiàn)出一致性，證明了WGS 可用于指導(dǎo)治療，并可用于發(fā)現(xiàn)新耐藥機(jī)制。

2012 年，在一次沙門氏菌疫情暴發(fā)中，PFGE無法將被污染的樣品與未被污染的同類食品區(qū)分開來；而WGS 技術(shù)不僅可以精確確定致病菌的物種亞型，而且可以檢測其對(duì)所有藥物的耐藥性[29]。Joensen 等[30-31]在應(yīng)用WGS 技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了一個(gè)能夠及時(shí)準(zhǔn)確識(shí)別產(chǎn)毒素大腸桿菌菌株的分型和監(jiān)測體系。Dallman 等[33]通過WGS 分析方法發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌病例之間的聚集性和關(guān)聯(lián)性，而且還發(fā)現(xiàn)了一些之前未發(fā)現(xiàn)的規(guī)模不大但分布較廣泛的聚集性疾病。對(duì)2007—2016 年加拿大散發(fā)的沙門氏菌病病例研究[33]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用WGS方法檢測出來的數(shù)據(jù)與流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相一致，而常規(guī)PFGE 方法則無法對(duì)以上不同的暴發(fā)事件進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。

由上可見，下一代測序技術(shù)與傳統(tǒng)病原微生物檢測技術(shù)相比，具有快速準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)勢(shì)，在病原微生物鑒別診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用。表1 列舉了二代和三代測序的特點(diǎn)[7]。

表1 主要的下一代測序技術(shù)比較

下一代測序技術(shù)以其明顯的優(yōu)勢(shì)成為近年來研究應(yīng)用的熱點(diǎn)，但它也存在劣勢(shì)：低豐度的致病菌在樣本量不足時(shí)容易被其他序列信息掩蓋，同時(shí)該技術(shù)也不能獲得菌株進(jìn)行下游試驗(yàn)研究。所以，下一代測序數(shù)據(jù)在現(xiàn)階段更多的是作為補(bǔ)充，但隨著微生物組學(xué)的發(fā)展和配套生物信息方法學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)，它也將成為食源性致病菌基因組數(shù)據(jù)平臺(tái)中不可或缺的一部分[36]。

3 在食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別中的應(yīng)用

3.1 生鮮動(dòng)物產(chǎn)品

Edirmanasinghe 等[37]在對(duì)來自禽肉、屠宰場的家畜胴體和人類的腸炎沙門氏菌分離株進(jìn)行WGS 分析和表型特征鑒定后，證明了腸炎沙門氏菌分離株在家畜、零售家禽和人類之間的傳播。Zagdoun 等[38]將Illumina MiSeq 測序方法應(yīng)用于豬肉火腿的微生物細(xì)菌多樣性分析調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在其制作成火腿過程中（尤其是切片步驟）比生肉具有更高的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。

針對(duì)2014 年5—9 月在英國暴發(fā)的腸炎沙門氏菌病，研究人員對(duì)來自英國和歐洲其他國家病例的分離株進(jìn)行了WGS 分析，證實(shí)英國的疫情與一家德國生產(chǎn)商的雞蛋有關(guān)[39]；2014 年6 月，研究人員使用下一代文庫制備和Illumina HiSeq 2500 測序技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，法國6 起沙門氏菌病的暴發(fā)與1起奧地利沙門氏菌病有關(guān)，而法國和奧地利腸炎沙門氏菌病的暴發(fā)則與上述德國生產(chǎn)商供應(yīng)的雞蛋有關(guān)[39]。WGS 以前曾被用于沙門氏菌的前瞻性監(jiān)測[40]以及多國沙門氏菌疫情暴發(fā)監(jiān)測，但在這里，它首次被用于實(shí)時(shí)鑒定多國沙門氏菌暴發(fā)，并及時(shí)告知相關(guān)部門應(yīng)采用的公共衛(wèi)生控制措施[41]。

2015 年5 月—2018 年10 月，研究人員在歐盟和歐洲經(jīng)濟(jì)區(qū)調(diào)查了一起大型腸炎沙門氏菌疫情的多國暴發(fā)事件[42-44]，他們使用WGS 進(jìn)行了一項(xiàng)病例對(duì)照研究，包括對(duì)從登記人口中隨機(jī)抽樣的確診/疑似病例以及2016 年10 月在食品機(jī)構(gòu)進(jìn)食的病例進(jìn)行食品追溯對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)來自波蘭的雞蛋是感染媒介；通過系統(tǒng)發(fā)育分析，在人類病例中發(fā)現(xiàn)了兩株腸炎沙門氏菌，隨后在波蘭雞蛋的主要生產(chǎn)場所中發(fā)現(xiàn)了同樣的腸炎沙門氏菌株，從而證實(shí)疫情來源。可見，在雞蛋這種微生物污染較低的產(chǎn)品中，下一代測序技術(shù)在致病菌風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和監(jiān)測方面發(fā)揮了很大優(yōu)勢(shì)。

目前，我國尚無利用下一代測序技術(shù)進(jìn)行食源性疾病暴發(fā)后病原溯源的相關(guān)報(bào)道，但已有研究采用WGS 技術(shù)分析畜產(chǎn)品中微生物組成。有學(xué)者[45]在我國西藏和俄羅斯采集自然發(fā)酵的牛奶，應(yīng)用高通量技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)來自不同地域的牛奶樣品中微生物群落具有明顯差異。另有學(xué)者[46]運(yùn)用基于16S rDNA 基因的高通量測序（HTS）技術(shù)對(duì)冷藏（4 ℃）豬肉的細(xì)菌微生物群落等進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)假單胞菌、不動(dòng)桿菌和發(fā)光細(xì)菌在冷藏豬肉中占優(yōu)勢(shì)，并且這些分類群可加速冷藏豬肉腐敗。

3.2 生鮮植物產(chǎn)品

下一代測序技術(shù)同時(shí)也已應(yīng)用于生鮮植物產(chǎn)品危害因子監(jiān)測。如沙門氏菌污染的番茄已多次造成食源性疾病暴發(fā)，Ottesen 等[47]利用MiSeq DNA 測序及mNGS 技術(shù)成功從番茄樣本中鑒別出沙門氏菌；Leonard[48]等從菠菜中識(shí)別到產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌；Andreevskaya 等[49]運(yùn)用SOLiD 測序技術(shù)對(duì)豆類乳桿菌進(jìn)行WGS 分析，發(fā)現(xiàn)其腐敗功能與丙酮酸代謝途徑異常有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了該菌的特有基因。

2014 年9 月，美國CDC 收集了從全美病人、食品及環(huán)境中分離到的所有單增李斯特菌株，運(yùn)用WGS 分析發(fā)現(xiàn)幾名患者的分離菌株與食用豆芽有關(guān)[50]，在運(yùn)用了WGS 分析后的3 年內(nèi)，共監(jiān)測識(shí)別和解決了多達(dá)14 起的單增李斯特菌小規(guī)模暴發(fā)事件[50-51]。2014 年3 月，美國監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)被單增李斯特菌污染的生菜，僅使用PFGE 很難建立與同期患者分離株的聯(lián)系，然而應(yīng)用WGS 分析表明來自俄亥俄州一名患者的分離株與生菜分離株高度相關(guān)[52]。

4 在食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)溯源中的應(yīng)用

4.1 大腸桿菌

2011 年5 月，大腸桿菌O104:H4 型在德國暴發(fā)并且迅速蔓延。流行病學(xué)調(diào)查[53]顯示，埃及進(jìn)口的豆芽是此次疫情暴發(fā)的源頭；傳統(tǒng)微生物學(xué)方法[54]顯示，此次暴發(fā)菌株的亞型和表型特征均相同；WGS 分析[55]發(fā)現(xiàn)，引起這起嚴(yán)重疫病暴發(fā)的菌株可能是通過水平轉(zhuǎn)移的方式，獲得了編碼志賀毒素的相關(guān)致病因子。2011 年在對(duì)德國暴發(fā)的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（O104:H4 型）腹瀉糞便樣品研究中，已經(jīng)證實(shí)WGS 可應(yīng)用于食源性疾病暴發(fā)后病原體鑒別[56]。Underwood 等[57]選取一項(xiàng)早期大腸桿菌（O157:H7 型）暴發(fā)研究中患者及動(dòng)物樣品，利用WGS 進(jìn)行比較分析及致病菌鑒別，證明5 種亞型致病菌在感染人類前廣泛分布于該農(nóng)場區(qū)域，傳染源是動(dòng)物和環(huán)境。

Saltykova 等[58]通過計(jì)算機(jī)模擬宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)，將碎肉分離株與產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）暴發(fā)期間收集的人源分離株聯(lián)系起來，證明mNGS可用于食源性疾病暴發(fā)的溯源追蹤。Schaeffer[59]利用三代測序技術(shù)對(duì)大腸桿菌其他7 株分離自非洲的大腸桿菌以及4 株屬于其他血清型的大腸桿菌進(jìn)行WGS 分析，數(shù)據(jù)顯示導(dǎo)致德國疾病暴發(fā)的大腸桿菌與其他大腸桿菌菌株不同，其屬于大腸桿菌另一個(gè)分支。

4.2 沙門氏菌

2009 年7 月，用于制作意大利臘腸的胡椒被沙門氏菌污染而引起食源性疾病暴發(fā)，Bakker等[60]選取暴發(fā)時(shí)的分離菌株和暴發(fā)前的菌株，經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)這些菌株具有完全相同的PFGE 圖譜，無法識(shí)別出暴發(fā)菌株；而通過wgSNP（基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性分型）分析，不僅能夠?qū)Ρ敬伪┌l(fā)的相關(guān)菌株進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別，而且還監(jiān)測到之前一些未發(fā)現(xiàn)的引起小型暴發(fā)的菌株。這充分表明wgSNP 分子分型技術(shù)在暴發(fā)致病菌的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和溯源分析上比傳統(tǒng)PFGE 技術(shù)具有更高的分辨力和準(zhǔn)確度。

Ashton 等[61]應(yīng)用二代測序技術(shù)中的Illumina HiSeq 平臺(tái)對(duì)2013 年暴發(fā)的沙門氏菌病進(jìn)行了WGS 分析，證明了在蛋黃醬中分離到的鼠傷寒沙門氏菌是導(dǎo)致此次疾病暴發(fā)的病原菌。Hoffmann等[62]利用WGS 技術(shù)查明了造成金槍魚刮板被污染的400 多種腸炎沙門氏菌亞種的來源。

4.3 單增李斯特菌

Ruppitsch 等[63]對(duì)單增李斯特菌血清型代表菌株和暴發(fā)菌株進(jìn)行wgMLST（全基因組多位點(diǎn)序列分型）分析方法應(yīng)用比較，結(jié)果顯示wgMLST技術(shù)可以準(zhǔn)確區(qū)分不同暴發(fā)的菌株以及與暴發(fā)相關(guān)或不相關(guān)的菌株。同時(shí)，wgMLST 技術(shù)可對(duì)MLST和PFGE 技術(shù)分型結(jié)果一致而流行病學(xué)卻并不相關(guān)的菌株加以區(qū)分。Gilmour 等[64]運(yùn)用WGS 技術(shù)成功鑒別出2008 年加拿大食源性疾病暴發(fā)的致病菌為李斯特菌。

mNGS 在檢測受污染冰淇淋中的單增李斯特菌方面具有優(yōu)勢(shì)，并有研究[65]證明其可以將目前追溯所需時(shí)間減少一半?？梢姡乱淮鷾y序技術(shù)不僅可以發(fā)現(xiàn)菌株，還能精確了解病原菌的傳播源頭，明確傳播途徑等，甚至能夠精確區(qū)分疾病大流行中不同暴發(fā)事件的先后順序，同時(shí)還能發(fā)現(xiàn)其中隱藏的小疾病的聚集性暴發(fā)，這一點(diǎn)傳統(tǒng)分子分型方法難以做到，而這些特點(diǎn)在疾病追溯和預(yù)防控制中至關(guān)重要。

5 展望

目前二代測序技術(shù)占據(jù)主流市場，相信在不遠(yuǎn)的未來三代測序技術(shù)會(huì)逐漸普及到各行各業(yè)。屆時(shí)，四代、五代等更先進(jìn)的測序技術(shù)也將應(yīng)運(yùn)而生，甚至成為未來實(shí)驗(yàn)室分析以及食品中食源性致病菌的常規(guī)檢測手段。二代和三代測序技術(shù)各有其優(yōu)勢(shì)及缺點(diǎn)，因此在實(shí)際檢測時(shí)應(yīng)選擇合適方法，甚至2 種及以上方法結(jié)合使用。希望未來下一代測序技術(shù)能與更多新興方法相結(jié)合，使其不僅可應(yīng)用于食源性致病菌的檢測識(shí)別及溯源，還能為更好地推動(dòng)食品安全事業(yè)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。