董仙蘭，王 瓊，韓佃剛，董 俊，楊云慶，祝 賀，葉玲玲，張 沖，尹尚蓮，李瑤瑤，何昌霖，羅倩敏，艾 軍

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.中國科學(xué)院昆明動物研究所，云南昆明 650223；3.昆明海關(guān)技術(shù)中心，云南昆明 650200）

流行性出血病（epizootic haemorrhagic disease，EHD）是由呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）的流行性出血病病毒（epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV）引起的，以侵害反芻動物為主的一類蟲媒性傳染病[1]。EHDV 通過庫蠓（Culicoides）吸血性叮咬傳播[2]，可感染包括鹿、牛、羊在內(nèi)的多種反芻動物[3]，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展及國際貿(mào)易。

EHD 呈世界分布，廣泛分布于美洲、非洲、大洋洲以及亞洲的熱帶與亞熱帶地區(qū)[4]。我國的云南、貴州、四川、廣東和河北等多個(gè)省份均有EHD 流行[5-6]。目前在世界范圍已有9 種血清型的EHDV（EHDV-1、2、4、5、6、7、8、9、10）被發(fā)現(xiàn)。不同血清型病毒間缺乏交叉免疫保護(hù)，致病性也存在較大差異，因而給EHD 防控帶來極大挑戰(zhàn)[7]。我國主要流行5 種血清型EHDV（EHDV-1、5、6、7、8）[8-9]，不同血清型EHDV 毒株之間的核酸序列差異可達(dá)56.2%，同一種血清型不同地域分離毒株的Seg-2 核酸序列差異也可達(dá)29.4%[10-11]，表明流行于我國的EHDV具有高度的血清型多樣性，這給我國牛羊養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

目前國內(nèi)外EHDV 檢測方法主要分為病原檢測和抗體檢測，其中病原檢測包括病毒分離鑒定、RT-PCR、熒光定量RT-PCR、逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（RT-RPA）以及特異性可視化RT-LAMP 現(xiàn)場檢測等[12]，抗體檢測包括競爭ELISA（C-ELISA）、血清中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)等。而EHDV 檢測國內(nèi)尚未見ELISA 商品化試劑盒。本研究在BHK-21 細(xì)胞上增殖EHDV，滅活濃縮后，以制備的鼠源性EHDV 單克隆抗體為阻斷抗體，建立了一種EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測方法，并優(yōu)化反應(yīng)條件，試制了EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒，以期為我國EHD 防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

BHK-21 細(xì)胞、EHDV-2 型病毒以及EHDV 單克隆抗體細(xì)胞株E2C5、臨床血清樣本，均為昆明海關(guān)技術(shù)中心動檢實(shí)驗(yàn)室保存；IgG-HRP 羊抗鼠二抗，購自KPL 公司（USA，貨號074-1806，1.0 mg），用抗體保護(hù)劑（USA，KPL 公司產(chǎn)品）按產(chǎn)品說明書稀釋；ID Screen? EHDV Competition 檢測試劑盒，購自法國ID.vet 公司。

相關(guān)試劑：包被液，0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液（pH9.6）；封閉液，購自Sigma 試劑公司；洗滌液，含0.5% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液；底物液（單組份可溶性TMB），購自TIANGEN（中國）生物有限公司；終止液，1 mol/L 的硫酸。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備與粗提 用BHK-21 細(xì)胞增殖EHDV，滅活后超聲破碎；利用飽和硫酸銨進(jìn)行蛋白濃縮，測蛋白濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 腹水制備及純化（1）腹水制備：BALB/c小鼠腹腔注射降植烷，0.5 mL/只；1 周后腹腔注射單克隆抗體細(xì)胞E2C5，待小鼠腹部漲圓時(shí)，適時(shí)收取腹水。（2）腹水純化：腹水12 000 r/min 離心5 min，取上清5 mL，加入20 mL 醋酸緩沖液，混勻后，緩慢加入825 μL 辛酸，邊加邊攪動；加完后繼續(xù)攪拌30 min，2～8 ℃ 12 000 r/min 離心30 min；將上清用濾紙過濾，并用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0～7.4，按終體積45%的比例加入飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，加完繼續(xù)攪拌30 min，置于2～8 ℃沉淀4～5 h；2～8 ℃ 12 000 r/min離心30 min；用3 mL Tris-HCl 將沉淀重懸，裝入透析袋（MW 8 000～14 000），在Tris-HCl 中于2～8 ℃透析14 h，12 000 r/min 離心5 min，取上清用Tris-HCl 定容至5 mL，即獲得提純單抗。

1.2.3 EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測方法建立

1.2.3.1 抗原最佳包被濃度和單克隆抗體最佳稀釋度確定 用0.05 mol/L pH9.6 的碳酸鹽緩沖液，將制備好的抗原按1:25、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1 000 稀釋包被；單克隆抗體按1:25、1:50、1:100、1:200 稀釋，IgG-HRP 羊抗鼠二抗作1:1 000 稀釋，進(jìn)行方陣滴度試驗(yàn)，以確定抗原最佳包被濃度和單抗的最佳稀釋度。

1.2.3.2 樣品稀釋液確定 分別使用磷酸鹽緩沖液、含1%BSA 的磷酸鹽緩沖液、含5%BSA 的磷酸鹽緩沖液，以及含0.5% BSA、0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行阻斷ELISA 檢測，確定最佳樣品稀釋液。

1.2.3.3 待檢血清和IgG-HRP 羊抗鼠二抗最佳稀釋度確定 參照ID Screen? EHDV Competition 檢測試劑盒，將血清分別進(jìn)行1:2、1:2.5、1:5、1:10稀釋，IgG-HRP 羊抗鼠二抗分別作1:500、1:1 000、1:2 000、1:2 500 稀釋，進(jìn)行方陣滴度試驗(yàn)，以確定待檢血清和IgG-HRP 羊抗鼠二抗最佳稀釋度。

1.2.3.4 封閉液選擇 分別以1%、5%、10%的BSA 以及1%的明膠、1%的馬血清作為封閉液進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳封閉液。

1.2.3.5 各程序最佳時(shí)間確定 在已經(jīng)確定的最優(yōu)條件下，檢測6 份不同陰性臨床樣品，逐一確定最佳封閉時(shí)間（4 ℃過夜、37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h）、待檢血清最佳反應(yīng)時(shí)間（30、45、60 min）、單克隆抗體最佳反應(yīng)時(shí)間（30、45、60 min）、IgGHRP 羊抗鼠二抗反應(yīng)時(shí)間（30、45、60 min）和底物最佳作用時(shí)間（5、10、15、20 min）。

1.2.3.6 阻斷ELISA 臨界值確定 運(yùn)用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 方法檢測90 份陰性參考血清，根據(jù)S/M確定陰陽性臨界值確定研制的EHDV阻斷ELISA 檢測試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算公式：S/M=血清樣品OD 值/ 單克隆抗體對照孔平均OD 值）×100%。

1.2.3.7 阻斷ELISA 方法特異性確定 用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 法，對EHDV-1、5、6、7、8型血清，以及藍(lán)舌病病毒（BTV）、小反芻獸疫病毒（PPRV）、口蹄疫O 型病毒（FMDV-O）、赤羽病病毒（AKV）、水泡性口炎病毒（VSV）的陽性血清（BHK 細(xì)胞免疫山羊制備）和BHK 細(xì)胞上清進(jìn)行檢測，以確定該方法的特異性。

1.2.3.8 阻斷ELISA 方法敏感性確定 對標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別進(jìn)行1:20、1:40、1:60、1:80 稀釋，用ID Screen? EHDV Competition 檢測試劑盒和本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 法進(jìn)行對比測試，以確定該試劑盒的敏感性。

1.2.3.9 阻斷ELISA 方法符合率確定 用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 法和ID Screen? EHDV Competition 檢測試劑盒同時(shí)對應(yīng)檢測臨床樣品，從而計(jì)算該方法與商品化試劑盒的符合率。

1.2.3.10 阻斷ELISA 方法批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次試制的試劑盒，對經(jīng)ID Screen? EHDV Competition 試劑盒檢測的樣品進(jìn)行檢測，計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.3.11 阻斷ELISA 方法批間重復(fù)性試驗(yàn) 取不同批次試制的試劑盒，對經(jīng)ID Screen? EHDV Competition 試劑盒檢測的樣品進(jìn)行檢測，計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.3.12 保存期試驗(yàn) 將組裝的試劑盒中各試劑密封（顯色液避光保存），包被好的ELISA 板放于避光封口袋中封口，全部放于4 ℃存儲。試劑性狀檢測：在保存期間，每隔1 個(gè)月觀察1 次組裝試劑盒中各試劑性狀，若試劑清澈、透明、無絮狀沉淀判為合格。敏感性檢測：每個(gè)月對組裝試劑盒敏感性進(jìn)行1 次檢測，取EHDV 陽性血清作1:10～1:60 倍比稀釋，然后用該試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 抗體檢測方法進(jìn)行檢測，計(jì)算其檢出為陽性的最低血清濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測方法建立

2.1.1 最佳包被濃度及最佳稀釋度確定 在二抗?jié)舛葹?:1 000 稀釋的條件下，進(jìn)行抗原和單抗的矩陣篩選，發(fā)現(xiàn)抗原1:100（27.3 μg/mL）稀釋時(shí)，OD 值在1.0 以上，考慮到ELISA 檢測儀讀數(shù)的精確度，抗原最佳包被濃度為1:100（27.3 μg/mL），單克隆抗體最佳稀釋度為1:100；同樣的方法可得待檢血清最佳稀釋度為1:2.5，IgG-HRP 羊抗鼠二抗最佳稀釋度為1:1 000。稀釋液選擇結(jié)果顯示，含0.5% BSA、0.05% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液稀釋樣品時(shí)，陰性血清OD 值最接近1.0，同時(shí)PI值最大，因此確定最佳稀釋液為含0.5% BSA、0.05% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液。

2.1.2 最佳反應(yīng)條件選擇 用不同的封閉液同時(shí)對陽性、弱陽、陰性血清測試，考慮到試劑盒穩(wěn)定性，確定最佳包被條件為4 ℃過夜，最佳封閉液為5%的BSA，最佳封閉條件為37 ℃ 1 h，待檢血清最佳反應(yīng)條件為37 ℃ 45 min，單克隆抗體最佳反應(yīng)條件為37 ℃ 45 min，IgG-HRP 羊抗鼠二抗最佳反應(yīng)條件為37 ℃ 45 min，底物最佳作用條件為37 ℃靜置15 min。

2.1.3 臨界值確定 運(yùn)用本試驗(yàn)建立的EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測方法檢測90 份陰性參考血清，求得90 份陰性參考血清的平均值=78.41，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）=6.34，確定陰陽性臨界點(diǎn)為-3SD=59.40，即待檢血清的檢測結(jié)果S/M＜60時(shí)判為陽性，≥60 時(shí)判為陰性。

2.2 操作程序

本研究通過EHDV 抗原和單克隆抗體，建立了檢測EHDV 的阻斷ELISA 抗體檢測方法，并對該檢測方法的各個(gè)步驟進(jìn)行了條件優(yōu)化，確定了此方法的最佳操作程序：用0.05 mol/L pH9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋濃縮的EHDV 至1:100（27.3 μg/mL），100 μL/孔過夜包被板；PBST 洗板3 次，300 μL/孔，拍干；加入5%的封閉液37 ℃封閉60 min；PBST洗板3 次，300 μL/孔，拍干；加入1:2.5 稀釋的待檢血清，50 μL/孔，37 ℃作用45 min；不洗板，加入1:100 稀釋的單克隆抗體，37 ℃反應(yīng)45 min；PBST 洗板3 次，300 μL/孔，拍干；加入1:1 000稀釋的IgG-HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)45 min；PBST 洗板3 次，300 μL/孔，拍干；加入底物液，100 μL/孔，37 ℃避光靜置顯色15 min；加終止液，100 μL/孔終止反應(yīng)，酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD450nm值，根據(jù)公式計(jì)算S/M值。

2.3 特異性確定

用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA法，對EHDV-1、5、6、7、8 型血清，以及BTV、PPRV、FMDV-O、AKV、VSV 陽性血清（BHK 細(xì)胞免疫山羊制備）和BHK 細(xì)胞上清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)S/M值分別為20.87、19.89、18.96、21.25、21.56、67.38、80.11、93.21、84.56、83.28、73.74，根據(jù)臨界值判定EHDV-1、5、6、7、8 型病毒為陽性，其他病毒為陰性，表明該方法有良好的特異性。

2.4 敏感性確定

用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 抗體檢測方法和ID Screen? EHDV Competition 試劑盒同時(shí)檢測1:10、1:20、1:40、1:60、1:80 稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果一致，說明該試劑盒具有較好的敏感性。

2.5 符合率確定

用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒和ID Screen? EHDV Competition 試劑盒同時(shí)檢測臨床樣品200 份，發(fā)現(xiàn)與參考試劑盒的符合率達(dá)97.00%，Kappa 值為0.93（表1）。

表1 兩種試劑盒200 份臨床樣品的ELISA 抗體檢測結(jié)果 單位：份

2.6 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次試制的EHDV ELISA 抗體檢測試劑盒檢測6 份不同陰性、陽性臨床樣本，發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)為2.67%～8.70%（表2），說明該方法具有良好的可重復(fù)性。

表2 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 %

2.7 批間重復(fù)性試驗(yàn)

取不同批次試制的EHDV ELISA 抗體檢測試劑盒檢測6 份不同陰性、陽性臨床樣本，發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)為3.14%～9.02%（表3），說明該方法具有良好的可重復(fù)性。

表3 批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 %

2.8 保存期試驗(yàn)

取組裝的同批次試劑6 盒，置于4 ℃。在保存的6 個(gè)月內(nèi)，每月隨機(jī)選取1 個(gè)試劑盒，進(jìn)行試劑性狀和敏感性檢測試驗(yàn)。試劑性狀檢測結(jié)果顯示，各試劑均清澈、透明、無絮狀沉淀存在。敏感性檢測結(jié)果（表4）顯示，在6 個(gè)月內(nèi)，組裝試劑盒的最低陽性檢出稀釋度均為1:40。

表4 保存期試驗(yàn)結(jié)果 %

3 討論

我國內(nèi)地雖然在牛羊血清中檢測到了EHDV陽性抗體，但暫無EHD 暴發(fā)記錄。曹穎穎等[13]利用微量細(xì)胞中和試驗(yàn)開展EHDV 血清型調(diào)查，在廣西黃牛、奶牛血清中檢出EHDV-5、6、7、8 型中和抗體，同時(shí)也分離出EHDV-5、8 型毒株，說明廣西境內(nèi)存在EHDV 感染，并存在EHDV-5、8血清型流行。楊振興等[5]在云南省牛和山羊的體內(nèi)均檢測出了EHDV 抗體，朱沛等[14]在云南省反芻動物的體內(nèi)分離出EHDV-5 型毒株，說明云南省反芻動物中存在EHDV 感染。因此，預(yù)防及控制該病是當(dāng)前我國面臨的問題。而開發(fā)EHDV 血清型特異性診斷技術(shù)，對深入開展我國EHD 流行病學(xué)調(diào)查與防控技術(shù)研究均具有重要實(shí)際意義。目前國內(nèi)尚無商品化的ELISA 抗體檢測試劑盒，而國外的抗體檢測試劑盒較昂貴，且不能滿足國內(nèi)市場需求，因此本研究有很強(qiáng)的實(shí)際意義。

用本研究建立的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，對我國已鑒定到的EHDV-1、5、6、7、8 陽性血清進(jìn)行測試，結(jié)果均是陽性，說明該試劑盒對EHDV具有一定通用性，同時(shí)對BTV、FMDV-O、AKAV陽性血清和BHK 細(xì)胞均是陰性，說明該試劑盒具有良好的特異性，能較好地與其他病毒進(jìn)行特異性區(qū)分；可檢測的最高陽性血清濃度為1:60，與ID Screen? EHDV Competition 試劑盒敏感性一致。

我國是牛羊養(yǎng)殖大國，對EHD 進(jìn)行防控，需進(jìn)行大量樣品檢測，如果用國際通用的ID Screen?EHDV Competition 試劑盒，則檢測成本較高，將花費(fèi)大量經(jīng)費(fèi)。而本研究建立的EHDV 抗體ELISA 檢測方法檢測成本低，適合國內(nèi)使用，將為我國EHD 防控節(jié)約大量經(jīng)濟(jì)成本，對EHD 防控具有重要意義。