王作勝 王芳 張秀秀

(日照市中心醫(yī)院腫瘤科，山東 日照 276800)

腫瘤的轉移主要是通過直接浸潤、淋巴及血液循環(huán)中的循環(huán)腫瘤細胞三種途徑實現。腫瘤細胞同質性粘附降低，從原發(fā)灶脫離，之后與細胞外基質( Extracell-ular Matrix，ECM)發(fā)生異質性粘附，并導致其受到破壞或降解，同時腫瘤細胞與ECM大分子相互作用，形成腫瘤進入細胞并且形成逃避免疫系統(tǒng)的通道?；|金屬蛋白酶(matrix Metallo-proteinases，MMPs)是ECM降解代謝的主要酶類，其中，基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)與腫瘤的侵襲轉移最密切[1-2]。葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)是參與內質網新生肽聚集、調節(jié)內質網鈣穩(wěn)態(tài)、抗內質網相關性細胞凋亡，也是未折疊蛋白反應(UPR)的核心調節(jié)因子，在腫瘤的增殖、凋亡以及侵襲轉移中發(fā)揮重要的作用[3-5]。本研究主要探討乳腺癌細胞株MCF-7的黏附及遷移能力與GRP78的關系及調控機理。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌細胞MCF-7，江蘇凱基生物技術股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶，Hyclone公司；Lipofectamine 2000、G418、500U/mL青/鏈霉素，美國Invitrogen公司；明膠，碧云天(上海)生物技術有限公司；pEGFP-N1-GRP78及pEGFP-N1質粒，上海吉凱基因化學技術有限公司；Matrigel膠，前塵(上海)生物制劑有限公司；GRP78、MMP-2、MMP-2抗體及二抗，均來自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1MCT-7細胞的培養(yǎng)及轉染 用RPMI1640+10% FBS+100 U/ mL青霉素—鏈霉素培養(yǎng)基置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后吸棄培養(yǎng)基，加入PBS洗3次后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶置于培養(yǎng)箱中30 s，消化，加入10%FBS終止消化。加入培養(yǎng)基重懸細胞，調節(jié)細胞濃度至6×105個接種于直徑40 mm的培養(yǎng)皿，每皿加2 mL培養(yǎng)基。24 h后，細胞融合到80%～90%時，按照Lipofectamine2000說明書將pEGFP-N1空載體、pEGFP-N1-GRP78質粒轉染到MCF-7細胞中。72 h后，吸棄原有培養(yǎng)基并更換為含有400 μg/mLG418培養(yǎng)基，以此篩選可以在G418培養(yǎng)基中生存的細胞。

1.2.2細胞黏附試驗 將濃度為12.6 g/L的 Matrigel母液用PBS稀釋成50 mg/L，100 μL/孔加入六孔板中，對照孔中加入等體積的1%BSA于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄上清，4℃保存?zhèn)溆?。分別收集生長狀態(tài)良好且處于對數生長期的MCF-7/UT、MCF-7/N1、MCF-7/GRP78細胞，調整細胞濃度至1×109個/L后接種于6孔板中，設3個平行復孔/組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，消化后加入PBS充分重懸細胞，并進行細胞計數，3個復孔細胞計數的平均值作為本組的黏附細胞總數，計算黏附率。黏附率(%)=粘附細胞總數/總細胞數×100%。

1.2.3細胞劃痕試驗 將消化下來的細胞用培養(yǎng)基重懸，并接種于直徑40 mm培養(yǎng)皿中，加入RPMI1640+10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)基2 mL/皿，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)想中過夜培養(yǎng)約10 h，第2天置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，若融合成單層細胞，取10 μL得移液槍頭平整得在培養(yǎng)皿上劃一直線，并馬上更換為RPMI1640+1% FBS培養(yǎng)基，分別于0、48 h后吸棄培養(yǎng)基，并在顯微鏡下觀察細胞的遷移情況。用Imagetool軟件計算遷徙率。遷徙率(%)=[(初始劃痕寬度值-現劃痕寬度值)]/初始劃痕寬度值×100%。

1.2.4Western blot檢測 RIPA+1 nmol/L PMSF裂解液裂解收集的三種細胞，提取細胞總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度，用TBS稀釋樣品至相同濃度，制作電泳樣品，并進行凝膠電泳，電泳完成后半干轉膜儀轉膜，1% BSA封閉，根據不同的分子量裁膜，分別加 GRP78、MMP2、 MMP9一抗，4℃過夜孵育，TBST洗滌3次，5 min/次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，5 min/次，洗滌結束后，置于Bio-Rad凝膠成像儀中進行顯色操作。Gel-Pro analyzer檢測條帶灰度值。

2 結 果

2.1轉染后各細胞中GRP78的表達情況 與其他兩組細胞(MCF-7/UT與MCF-7/N1)對比，GRP78在MCF-7/GRP78細胞中的表達水平更高(P<0.05)，MCF-7/UT與 MCF-7/N1細胞中GRP78的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 不同細胞中GRP78的表達(*P<0.05,**P>0.05)

2.2GRP78對細胞黏附能力的影響 MCF-7/UT、MCF-7/N1、MCF-7/GRP78三種細胞的遷移率(%)分別為：(32.1±1.75)、(31.99±1.01)、(45.80±1.5)。培養(yǎng)2 h后MCF-7/GRP78細胞的黏附率比另兩種細胞明顯增強，而MCF-7/UT、MCF-7/N1細胞黏附率并無明顯變化。見圖2。

圖2 不同細胞黏附率的大小(*P<0.05,**P>0.05)

2.3GRP78對細胞遷移能力的影響 MCF-7/UT、MCF-7/N1、MCF-7/GRP78在培養(yǎng)48 h后的遷移率分別為：(0.55±0.14)、(0.62±0.23)、(0.94±0.30)，由此得出MCF-7/GRP78細胞遷移能力更強。而MCF-7、MCF-7/N1細胞48 h后的遷移能力無明顯變化。見圖3。

圖3 不同細胞遷移率的大小(×100，*P<0.05,**P>0.05)

2.4Western blot檢測 MCF-7/GRP78細胞中MMP2、MMP9表達水平明顯升高(P<0.05)；MCF-7/UT與MCF-7/N1細胞中MMP2、MMP9表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 不同細胞MMP-2、MMP-9的表達水平(*P<0.05,**P>0.05)

3 討 論

乳腺癌作為女性健康“第二大殺手”，外科手術、放療及化療依然是治療的常規(guī)手段，這兩種方法對患者來說身心都飽受折磨。另外晚期患者往往會發(fā)生腫瘤轉移，常規(guī)的治療方法并不能從根本上阻止癌細胞的浸潤及轉移。腫瘤的侵襲轉移是一個多種機制參與的復雜過程，其影響因素至今尚未明確。MMPs作為一類金屬離子依賴的蛋白水解酶家族，其幾乎能降解細胞外基質中所有的蛋白成分，從而阻斷腫瘤侵襲的屏障，在調節(jié)細胞增殖、黏附、遷移、血管生成、細胞凋亡和宿主防御等方面起重要作用，在腫瘤侵襲轉移中的作用逐漸受到重視，被認為是該過程中的主要水解酶類之一[6]。目前發(fā)現人類的MMPs是由28個成員組成，參與許多不同的生理病理過程[7]。其中MMP-2和MMP-9起到了顯著的作用，研究[8-9]表明當細胞惡變時，MMP-2和MMP-9表達量會升高，這兩種細胞因子以酶原形式分泌，須水解后功能才能激活，激活后對阻擋癌細胞浸潤的組織屏障進行降解破壞，加速腫瘤細胞的侵襲轉移，而阻斷MMPs的功能后乳腺癌的侵襲則受到抑制，因此MMP-2、MMP-9與乳腺癌的侵襲轉移關系密切[10-11]。

為了進一步探討GRP78在乳腺癌細胞對正常細胞進行侵襲轉移時的作用機制，我們通過構建GRP78真核表達載體并將構建好的質粒轉染至MCF-7細胞中，并通過細胞黏附實驗及劃痕實驗評估未經處理的MCF-7細胞、轉染空質粒的細胞MCF-7-pEGFP-N1及轉染GRP78真核表達載體的細胞MCF-7-pEGFP-GRP78三種細胞的黏附及遷移能力；WesternBlot計算三種細胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表達水平。結果發(fā)現GRP78的表達量提高后，MCF-7細胞黏附、遷移能力及MMP-2、MMP-9的蛋白表達水平均明顯升高。證實GRP78能夠通過提高MMP-2及MMP-9的表達進而加速乳腺癌細胞的黏附及遷移。