盛陳卓婭,姚根新,張心榮,李 東

盛陳卓婭,浙江省湖州市德清縣人民醫(yī)院病理科 浙江省湖州市313200

姚根新,浙江省湖州市德清縣人民醫(yī)院超聲科 浙江省湖州市 313200

張心榮,浙江省湖州市德清縣人民醫(yī)院超聲科 浙江省湖州市 313200

李東,浙江醫(yī)院超聲科 浙江省杭州市 310013

0 引言

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤,其病死率居惡性腫瘤第二位,惡性程度高,轉(zhuǎn)移率高,預(yù)后較差[1,2].HCC發(fā)生發(fā)展涉及多基因的調(diào)控表達(dá)[3].酪氨酸蛋白激酶受體B4(ephrin type-B receptor 4,EphB4)是酪氨酸蛋白激酶受體家族中的一員,大量研究證實(shí)EphB4在多種人類惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),具有重要臨床意義[4].超聲造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)能對(duì)組織的微循環(huán)血流狀態(tài)進(jìn)行定量分析,能動(dòng)態(tài)真實(shí)反映其血供情況[5].本研究旨在檢測(cè)HCC肝癌組織與癌旁組織的EphB4表達(dá)水平差異,分析EphB4表達(dá)水平與CEUS血流灌注參數(shù)的相關(guān)性,以期為臨床判斷病情、評(píng)估預(yù)后提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2019-02/2021-03期間,在我院行手術(shù)切除治療的HCC患者作為研究對(duì)象,共52例,其中男38例,女14例,年齡28-77歲,平均55.9歲±13.2歲.納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均為單發(fā)病灶;(2)均經(jīng)病理證實(shí)為HCC;(3)術(shù)前未曾接受任何治療;(4)無(wú)造影劑過(guò)敏;(5)能配合檢查.病灶大小1.83 cm -5.78 cm,平均4.58 cm±1.04 cm.本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò).所有患者均知情同意,并簽署知情同意書(shū).

1.2 方法 CEUS檢查:采用Acuson S2000超聲診斷儀進(jìn)行檢查,選擇4C1探頭(頻率4.0 MHz),內(nèi)置定量分析軟件.首先行常規(guī)超聲掃查,明確病灶位置、大小、邊界、內(nèi)部回聲等一般情況.啟動(dòng)CEUS模式,以Sono Vue(意大利,Bracco公司)作為超聲造影劑,按說(shuō)明書(shū)制成混懸液.經(jīng)肘部淺靜脈快速推注2.4 mL,尾隨生理鹽水沖管,同步計(jì)時(shí)并存儲(chǔ)動(dòng)態(tài)圖像資料作后續(xù)分析.分別于肝癌組織、癌旁組織(距離腫瘤病灶邊緣1 cm處肝組織)選取實(shí)性部分作為感興趣區(qū),盡可能避開(kāi)大血管、囊性區(qū)以及壞死區(qū).感興趣區(qū)選取深度、大小應(yīng)保持一致.系統(tǒng)將自動(dòng)生成時(shí)間-強(qiáng)度曲線,獲得血流灌注參數(shù):峰值強(qiáng)度(maximum intensity,IMAX)、達(dá)峰時(shí)間(time to peak,TTP)、流出時(shí)間(washout time,WT).由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的副高職稱超聲科醫(yī)師進(jìn)行CEUS檢查,所有數(shù)據(jù)均測(cè)量3次取平均值.見(jiàn)圖1.

圖1 CEUS灌注參數(shù)示意圖.綠色線:肝癌組織的時(shí)間-強(qiáng)度曲線;黃色線:癌旁組織的時(shí)間-強(qiáng)度曲線.CEUS:超聲造影;IMAX:峰值強(qiáng)度;TTP:達(dá)峰時(shí)間;WT:流出時(shí)間.

1.3 EphB4表達(dá)水平及微血管密度測(cè)定 術(shù)后獲得HCC相應(yīng)局部肝癌組織以及癌旁組織標(biāo)本,用生理鹽水洗凈,加入RI-PA裂解液后充分研磨成研磨液,于4 ℃條件下離心20 min(12000轉(zhuǎn)/min),分離上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供)檢測(cè)EphB4表達(dá)量.

采用ElivisionTM二步法免疫組化染色,嚴(yán)格按照Weidner等研究者報(bào)道的方法[6],首先在40倍光鏡下觀察整張病理切片,選取3個(gè)“熱點(diǎn)”(血管高密度區(qū)),然后在200倍光鏡下計(jì)數(shù)血管數(shù).與周圍血管、結(jié)締組織細(xì)胞分開(kāi),且棕染的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)計(jì)數(shù)微血管.計(jì)數(shù)3次,取平均值作為微血管密度(microvessel density,MVD)最終值(圖2).

圖2 MVD檢測(cè).在200倍光鏡下,術(shù)后病理組織可見(jiàn)棕染的微血管.MVD:微血管密度.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù).計(jì)量資料表示為mean±SD,組間比較采用t檢驗(yàn).相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析.P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 不同組織間CEUS灌注參數(shù)比較 肝癌組織IMAX明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肝癌組織TTP、WT明顯短于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1).

表1 不同組織間CEUS灌注參數(shù)比較

2.2 不同組織間EphB4表達(dá)水平及MVD水平比較 肝癌組織EphB4表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肝癌組織MVD明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表2).

表2 不同組織間EphB4表達(dá)水平及MVD比較

2.3 CEUS灌注參數(shù)與EphB4表達(dá)水平相關(guān)性 肝癌組織中,EphB4表達(dá)水平與IMAX呈正相關(guān)(r=0.862,P<0.05),而EphB4表達(dá)水平與TTP、WT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.765,r=-0.781,P<0.05).

3 討論

HCC病灶內(nèi)有著十分豐富的血供,這與病灶內(nèi)血管新生過(guò)程旺盛密切相關(guān)[7].大量新生血管可為腫瘤組織細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及發(fā)展提供充足養(yǎng)分.全面了解HCC腫瘤內(nèi)的血供狀態(tài)及組織細(xì)胞增殖情況,不僅能為臨床判斷病情嚴(yán)重程度提供依據(jù),而且能為臨床選擇合適治療方案提供參考.

CEUS作為近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)超聲檢查新技術(shù),其在監(jiān)測(cè)組織微循環(huán)灌注方面有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì).CEUS是微米級(jí)純血池血管示蹤技術(shù),能敏感動(dòng)態(tài)反映組織內(nèi)微循環(huán)血流,進(jìn)而定量評(píng)估其血流特征[8].本研究結(jié)果顯示,肝癌組織IMAX明顯高于癌旁組織(P＜0.05),而TTP、WT明顯短于癌旁組織(P＜0.05).提示肝癌組織的整體血流量較癌旁組織豐富,且其血流動(dòng)力學(xué)特征為快速流入、達(dá)峰后快速流出,即為“快進(jìn)快出”的造影模式.原因可能是,一方面HCC以動(dòng)脈供血為主,腫瘤組織在多種血管生成因子作用下,生成大量不成熟微小血管,而這些微小血管具有較高通透性;另一方面,腫瘤組織內(nèi)存在大量動(dòng)靜脈短路,導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血流量增大,流速增快[9].MVD是目前公認(rèn)的能有效反映組織微血管生成狀態(tài)的可靠指標(biāo).本研究結(jié)果顯示,肝癌組織MVD明顯高于癌旁組織(P＜0.05).進(jìn)一步證實(shí)了HCC腫瘤組織內(nèi)存在大量新生微小血管.HCC腫瘤內(nèi)MVD明顯增加,是導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血流量增加,流速增快的重要原因之一.

HCC內(nèi)豐富的血供有利于腫瘤細(xì)胞增殖,而腫瘤細(xì)胞增殖受到原癌基因過(guò)表達(dá)影響.原癌基因具有促細(xì)胞增殖作用,在HCC病情發(fā)展中發(fā)揮著重要作用.EphB4作為 Ephrin家族中的一類酪氨酸蛋白激酶,一方面通過(guò)作用于Rac1/Akt通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,另一方面能通過(guò)作用于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲性生長(zhǎng)[10,11].本研究結(jié)果顯示,肝癌組織EphB4表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P＜0.05).提示EphB4表達(dá)水平上調(diào)與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).進(jìn)一步分析HCC腫瘤組織血流灌注參數(shù)與EphB4表達(dá)水平的相關(guān)性顯示:在肝癌組織中,EphB4表達(dá)水平與IMAX 呈正相關(guān),而與TTP、WT呈負(fù)相關(guān).提示HCC腫瘤組織的血流灌注狀態(tài)與EphB4表達(dá)調(diào)控關(guān)系密切.隨著HCC腫瘤組織內(nèi)血供增多,流速增快,EphB4表達(dá)量隨之上升,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移.

4 結(jié)論

CEUS能定量評(píng)估HCC腫瘤組織的微循環(huán)血流狀態(tài),其血流灌注參數(shù)與EphB4表達(dá)水平具有一定相關(guān)性,可為臨床評(píng)估EphB4表達(dá)水平提供參考.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

酪氨酸蛋白激酶受體B4(ephrin type-B receptor 4,EphB4)表達(dá)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,而病理學(xué)方法評(píng)估EphB4表達(dá)狀態(tài)具有創(chuàng)傷性,難以滿足術(shù)前評(píng)估要求.超聲造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)所具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),可為臨床無(wú)創(chuàng)性評(píng)估EphB4表達(dá)狀態(tài)提供一種可靠手段.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

采用CEUS定量分析HCC組織的血流灌注變化,從而間接評(píng)估其EphB4表達(dá)水平,為臨床無(wú)創(chuàng)性評(píng)估EphB4表達(dá)狀態(tài)提供參考.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

采用CEUS定量分析HCC血流灌注狀態(tài),進(jìn)而評(píng)估其EphB4表達(dá)水平.結(jié)果顯示:CEUS血流灌注參數(shù)與EphB4表達(dá)水平具有相關(guān)性,可間接評(píng)估HCC的EphB4表達(dá)水平.

實(shí)驗(yàn)方法

本篇論文采用CEUS定量分析HCC血流灌注變化與EphB 4表達(dá)水平的相關(guān)性.CEUS是一種純血池示蹤方法,可定量分析目標(biāo)組織的血流灌注特征.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本篇論文研究達(dá)到了實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo),研究結(jié)果顯示肝癌組織峰值強(qiáng)度(maximum intensity,IMAX)、EphB4表達(dá)水平及微血管密度(microvessel density,MVD)明顯高于癌旁組織(P＜0.05);肝癌組織達(dá)峰時(shí)間(time to peak,TTP)、流出時(shí)間(washout time,WT)明顯短于癌旁組織(P＜0.05);肝癌組織EphB4表達(dá)水平與IMAX、TTP、WT具有相關(guān)性.本研究結(jié)果說(shuō)明CEUS可無(wú)創(chuàng)性評(píng)估HCC的EphB4表達(dá)狀態(tài).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)HCC血流參數(shù)與EphB4表達(dá)水平具有一定相關(guān)性.本研究提出CEUS能有效反映HCC的EphB4表達(dá)水平,從而指導(dǎo)臨床治療.

展望前景

CEUS檢查時(shí),患者盡量放慢呼吸頻率,減少呼吸運(yùn)動(dòng)幅度,超聲醫(yī)師將腫瘤圖像置于顯示屏中央?yún)^(qū)域進(jìn)行觀察.本研究未來(lái)研究的方向是運(yùn)用CEUS判定HCC組織EphB4表達(dá)水平的診斷效能.本研究未來(lái)研究的最佳方法是CEUS聯(lián)合血管生成相關(guān)因子評(píng)估HCC的EphB4表達(dá)水平.