張 科 劉志良 陳雪琴 唐 牧 蔡 勇 黃傳生

乳腺癌是威脅全球女性健康的主要惡性腫瘤之一，同時它也是1種激素依賴性的異質(zhì)性疾病，其分子分型已成為近年的研究熱點(diǎn)。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)以及人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)均表達(dá)陰性的一類特殊亞型乳腺癌。與其他亞型乳腺癌相比較，三陰性乳腺癌侵襲性更強(qiáng)、預(yù)后更差。由于該類亞型乳腺癌缺乏有效的治療靶點(diǎn)，目前仍以化療作為其主要的治療手段[1]。乳腺癌易感基因1 (BRCA1)是1種腫瘤抑制蛋白，通過在DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和轉(zhuǎn)錄控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用來維持基因組的穩(wěn)定性[2]。雄激素受體(AR)是類固醇激素受體家族的一員，其在70%以上的乳腺癌和15%的TNBC中均有表達(dá)[3]，越來越多的證據(jù)支持AR在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，并與乳腺癌發(fā)病機(jī)制有關(guān)[4]。Ki-67 是由Gerdes 等[5]發(fā)現(xiàn)的1種與細(xì)胞有絲分裂周期密切相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原,可識別處在生長過程中正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,從而評估細(xì)胞的增生程度。其陽性表達(dá)能迅速可靠地反映惡性腫瘤的增殖率,并且該抗體與多種惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后均有關(guān)。本次研究對象為三陰性乳腺癌，我們設(shè)想通過檢測該亞型乳腺癌中BRCA1、AR及Ki67蛋白的表達(dá)情況，分析其三者之間的相互關(guān)系，探究三者與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為今后進(jìn)一步探究三陰性乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2020年12月于江西省腫瘤醫(yī)院收治住院的經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(ER、PR、Her-2等)確診的三陰性乳腺癌患者94例，所有病例臨床病理資料完整。均為女性患者，年齡32～78歲，中位年齡52.5歲；根據(jù)手術(shù)方式分為乳腺癌改良根治手術(shù)82例(87.3%)，乳腺單純腫塊切除術(shù)2例(2.1%)，乳腺腫塊粗針穿刺活檢10例(10.6%)；其中非特殊類型浸潤性導(dǎo)管癌91例(96.8%)，具髓樣特征的浸潤性癌2例(2.1%)，分泌性癌1例(1.1%)。乳腺癌分子分型采用免疫組織化學(xué)(IHC)替代分型，即2013年St.Gallen乳腺癌會議國際共識[6]中關(guān)于三陰性乳腺癌(ER、PR及HER-2均陰性表達(dá))的分型標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)二步法，嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。BRCAl抗體、AR抗體及Ki-67抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，其他有關(guān)指標(biāo)抗體及本次實(shí)驗(yàn)試劑均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。ER、PR染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)≥1%的腫瘤細(xì)胞核呈現(xiàn)不同程度的著色時，即為陽性，反之則為陰性[7]；AR染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：≥10%的腫瘤細(xì)胞核呈現(xiàn)不同程度的著色時，即為陽性，反之則為陰性[8]；Her2染色陰性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：無任何著色或任何比例的浸潤性癌細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細(xì)胞膜著色；Ki67染色結(jié)果判定：胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)10個高倍視野腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算陽性比率：<20%為低指數(shù)表達(dá)，≥20%為高指數(shù)表達(dá)；BRCA1染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒且數(shù)量>10%為陽性，≤10%為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，BRCA1、AR及Ki67的表達(dá)與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系分析采用校正的χ2Pearson檢驗(yàn)，P<0.05為具有顯著性差異；BRCA1與AR表達(dá)，BRCA1與Ki-67表達(dá)及AR與Ki-67表達(dá)之間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 BRCA1、AR及Ki-67蛋白在三陰性乳腺癌中的陽性表達(dá)率

BRCA1在三陰性乳腺癌中的陽性表達(dá)率為57.4%(54/94);AR在三陰性乳腺癌中的陽性表達(dá)率為35.1%(33/94)；Ki-67在三陰性乳腺癌中的陽性表達(dá)率為89.4%(84/94)。

2.2 BRCA1、AR及Ki-67表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

BRCA1蛋白、AR蛋白及Ki-67蛋白表達(dá)均與年齡無關(guān)，與發(fā)生腫塊的部位(左側(cè)或右側(cè)乳腺)無關(guān)(P均>0.1)。見表1。

表1 BRCA1、AR、Ki67表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系/例

2.3 BRCA1與AR的關(guān)系

Spearman相關(guān)性分析得出，BRCA1與AR在三陰性乳腺癌中的表達(dá)不相關(guān)，γ=0.182，P>0.05，見表2。

表2 BRCA1與AR表達(dá)在三陰性乳腺癌中的關(guān)系/例

2.4 BRCA1與Ki-67的關(guān)系

Spearman相關(guān)性分析得出，BRCA1與Ki67在三陰性乳腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，γ=-0.279，P<0.05，見表3。

表3 AR與Ki67表達(dá)在三陰性乳腺癌中的關(guān)系/例

表3 BRCA1與Ki67表達(dá)在三陰性乳腺癌中的關(guān)系/例

2.5 AR與Ki-67的關(guān)系

Spearman相關(guān)性分析得出，AR與Ki67在三陰性乳腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，γ=-0.252，P<0.05，見表4。

3 討論

乳腺癌是1種激素依賴性的異質(zhì)性疾病，對其分子分型的研究，已成為近年來眾多學(xué)者關(guān)注研究的熱點(diǎn)。根據(jù)乳腺癌組織中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體2(Her2)以及增殖細(xì)胞核抗原(Ki67)的表達(dá)情況，將乳腺癌分為4種亞型：即Luminal A型、Luminal B型、Her2過表達(dá)型和三陰性乳腺癌(TNBC)[9]。TNBC因其具有較高的復(fù)發(fā)率和病死率，預(yù)后較差，且目前尚無有效的內(nèi)分泌及靶向治療藥物[1]，因此該亞型乳腺癌是當(dāng)下研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。TNBC約占所有乳腺癌的15%，更常見于年輕女性和BRCA1突變攜帶者[10]。乳腺癌易感基因1 (BRCA1)，是1種腫瘤抑制蛋白，通過在DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和轉(zhuǎn)錄控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用來維持基因組的穩(wěn)定性[2]，Paul等研究發(fā)現(xiàn)BRCA1/2蛋白的失調(diào)和表達(dá)改變會增強(qiáng)乳腺癌的偶發(fā)形式[11]，這表明通過檢測BRCA1蛋白在乳腺癌中的表達(dá)情況可以在一定程度上提示腫瘤的進(jìn)展，這一觀點(diǎn)也與我們先前研究的關(guān)于BRCA1蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)具有顯著差異性不謀而合，聯(lián)合檢測BRCAl和Ki67對不同分子分型乳腺癌有一定的預(yù)測預(yù)后價值[12]。

ER及PR在乳腺癌中的作用機(jī)制已被深入研究，基于抗雌激素的治療手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，作為類固醇受體超家族的另一個重要成員AR也高度表達(dá)于乳腺癌組織中，但其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未完全闡明，還在不斷研究當(dāng)中。Barton等[13]研究發(fā)現(xiàn)AR在TNBC中的陽性表達(dá)率為12%～55%，Kono等研究顯示AR在TNBC中的陽性表達(dá)率為10%～35%[14]。我們對94例三陰性乳腺癌的AR表達(dá)情況進(jìn)行分析，AR陽性率為35.1%(33/94)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致，表明AR在三陰性乳腺癌中有著相對較高的陽性表達(dá)率。Barton等[13]的研究還發(fā)現(xiàn)AR陽性表達(dá)的TNBC對化療敏感性比較低，其原因可能是與AR陰性表達(dá)者相比較，AR陽性表達(dá)的TNBC的Ki67表達(dá)指數(shù)比較低，這與我們此次研究發(fā)現(xiàn)的AR陰性表達(dá)與Ki67高增殖表達(dá)(Ki67≥20%)顯著相關(guān)(P<0.05)的結(jié)論相一致。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AR陽性表達(dá)是預(yù)測TNBC無病生存率和總生存率的不良預(yù)后指標(biāo)[15]，這與另一篇報(bào)道里發(fā)現(xiàn)的AR陽性表達(dá)的TNBC有著復(fù)發(fā)延遲的現(xiàn)象以及更好的預(yù)后[10]的結(jié)論相悖。因此我們大膽猜測，在三陰性乳腺癌中一定還存在與AR相關(guān)聯(lián)的其他信號通路，影響著AR陽性表達(dá)的三陰性乳腺癌的進(jìn)展與預(yù)后，而這其中相關(guān)聯(lián)的信號通路會不會與BRCA1相關(guān)呢？

Zhang等在對149例非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者樣本的組織芯片研究發(fā)現(xiàn)BRCA1過表達(dá)可通過激活SIRT1顯著抑制乳腺癌細(xì)胞中AR的表達(dá)，最終他們的研究結(jié)果表明BRCA1通過SIRT1介導(dǎo)的途徑抑制AR刺激的乳腺癌細(xì)胞增殖[2]。Luo等[16]首次探討了AR、PARP1和BRCA1在TNBC中的相關(guān)性。他們發(fā)現(xiàn)BRCA1過表達(dá)后，AR和PARP1在mRNA和蛋白水平上表達(dá)降低。AR正向調(diào)控PARP1，而PARP1也上調(diào)AR在體外的表達(dá)。此外他們還通過使用TNBC患者樣本的組織芯片證實(shí)了在TNBC患者中BRCA1的表達(dá)與AR和PARP1呈負(fù)相關(guān)，而我們此次研究未發(fā)現(xiàn)BRCA1與AR表達(dá)有明顯相關(guān)性(P>0.05)，這些分歧可能與樣本來源、樣本數(shù)量及統(tǒng)計(jì)方法等存在差異有關(guān)，Luo等[16]的研究結(jié)果表明比卡魯胺和PARP抑制劑聯(lián)合使用可能是治療TNBC的一種潛在策略，值得進(jìn)一步評估。在另一篇大宗數(shù)據(jù)的meta分析中，筆者通過研究總結(jié)出在三陰性乳腺癌(TNBC)中，表皮生長因子受體(EGFR)的表達(dá)水平和BRCA1突變患病率的表達(dá)要高于非三陰性乳腺癌(non-TNBC)。相反，雄激素受體(AR)在TNBC的表達(dá)水平比非TNBC中要低。AR和EGFR的不同表達(dá)以及BRCA1突變的發(fā)生率提示AR、EGFR和BRCA1可能是TNBC靶向治療和預(yù)后的獨(dú)特的生物標(biāo)志物[17]。

BRCA1、AR在三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中與多條腫瘤相關(guān)信號通路的作用機(jī)制尚未完全闡明，同時關(guān)于兩者之間的相互關(guān)系及作用也尚未明確，但是BRCA1和AR在三陰性乳腺癌中的高陽性表達(dá)率及它們之間的交互作用為學(xué)者尋找三陰性乳腺癌的新治療方案和潛在治療靶點(diǎn)提供了理論支持，非常值得進(jìn)一步深入探究。