田樹興　丁艷譜　周崇富　劉紅光　李軍山

【摘要】目的：建立高效液相色譜法測(cè)定姜味草中齊敦果酸和熊果酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定姜味草中齊敦果酸和熊果酸的含量，色譜柱為Thermo Acclaim C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85∶15∶0.03∶0.06），檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速為0.8 mL·min^-1，柱溫為15℃。結(jié)果：齊敦果酸和熊果酸進(jìn)樣量在0.20～2.46 μg（R=0.9997）和0.49～6.15 μg（R=0.9999）范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的RSD<2%，平均加樣回收率分別為98.4%和98.3%，RSD分別為2.3%和2.7%。結(jié)論：本研究建立同時(shí)測(cè)定姜味草中齊敦果酸和熊果酸含量的方法，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且具有分離度好、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、供試品制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可為姜味草質(zhì)量評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)提升提供良好的方法和依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法; 姜味草; 齊敦果酸; 熊果酸; 含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2021）23-0052-04

Content Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Micromeria Biflora Benth

TIAN Shuxing^1，2DING Yanpu³ZHOU Chongfu^1，2LIU Hongguang^1，2LI Junshan^2，3

1.Yunnan Shineway Spirin Pharmaceutical Co. Ltd.， Chuxiong 675000，China;

2.Chuxiong Shineway Spirin Pharmaceutical Research Co. Ltd.， Chuxiong 675000，China;

3.Shineway Pharmaceutical Group Ltd.， Shijiazhuang 051430，China

Abstract：Objective To HPLC method was established for the determination of Oleanolic acid and ursolic acid in Micromeria biflora Benth. Methods The contents of Oleanolic acid and Ursolic acid in Micromeria biflora Benth were determined by HPLC，The chromatographic column is Thermo Acclaim C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），The mobile phase was methanol-water-Glacial acetic acid-Triethylamine（85∶15∶0.03∶0.06），The UV detection wavelength was 210 nm，The flow rate was 0.8 mL/min，The column temperature was 15℃. Results There was a goog linear relationship between the volume of oleanolic acid and ursolic acid in the range of 0.20～2.46 μg（R=0.9997） and 0.49～6.15 μg（R=0.9999），The RSDs of precision，stability，repeatability tests were less than 2%，The average recoveries were 98.4%（RSD=2.3%） and 98.3 %（RSD=2.7%）.Conclusion A method for simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in Micromeria biflora Benth，The results are accurate and reliable， with good separation， high sensitivity， high accuracy and simple preparation，It can provide a good method and basis for quality evaluation and standard promotion of Micromeria biflora Benth.

Key words：HPLC;Micromeria biflora Benth.;Oleanolic Acid;Ursolic Acid;Content Determination

姜味草為唇形科植物姜味草Micromeria biflora Benth.的干燥全草，別名地生姜、小姜草、小香草，味苦，辛，性溫，具有溫中散寒、理氣止痛的功效^[1-3]，分布于貴州、云南、西藏等地^[4]，是云南常用草藥。已有報(bào)道通過水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2提取姜味草中的揮發(fā)油，并采用CG-MS聯(lián)用法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析^[5];采用氣相色譜法對(duì)姜味草揮發(fā)油中橙花醛與香葉醛的含量進(jìn)行測(cè)定^[6];采用薄層色譜掃描法對(duì)云南不同產(chǎn)地姜味草中齊敦果酸的含量進(jìn)行測(cè)定^[7];采用高效液相色譜法對(duì)姜味草中非揮發(fā)性成分齊敦果酸和熊果酸的含量進(jìn)行測(cè)定^[8]。齊墩果酸和熊果酸具有抗氧化、抗癌、降血脂、降血糖和保肝等功效^[9-12]。通過實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜法測(cè)定姜味草中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，為姜味草的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2030 Plus高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;SK250LH超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）;MS105DU 電子天平（d=0.00001 g）（瑞士梅特勒公司）。

1.2 藥品與試劑 姜味草購(gòu)自云南祿豐縣勤豐鎮(zhèn)恒康中藥經(jīng)營(yíng)部（產(chǎn)地為云南祿豐及云南華寧）、四川南部縣旭豐中藥材農(nóng)民專業(yè)合作社（產(chǎn)地為四川都江堰），經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠主任中藥師鑒定為唇形科姜味草屬植物姜味草Micromeria biflora Benth.的干燥全草。齊敦果酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110709-20188，純度91.1 %）;熊果酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110742-201823，純度99.9 %）;甲醇（色譜純，德國(guó) Merck 公司）;乙醇（分析純）;冰醋酸（分析純）;三乙胺（分析純）;實(shí)驗(yàn)室用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取齊敦果酸對(duì)照品10.80 mg和熊果酸對(duì)照品24.64 mg，置100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液（其濃度分別為98.39 μg·mL^-1和246.15 μg·mL^-1）。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取姜味草粉末（過三號(hào)篩）約1.0 g，置150 mL的量瓶中，加入90 %乙醇25 mL超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，取出放至室溫，用90 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱為Thermo C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85∶15∶0.3∶0.5）;柱溫為15℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;流速為0.8 mL·min^-1;進(jìn)樣量為10 μL。在色譜條件下齊敦果酸和熊果酸可達(dá)到基線分離，齊敦果酸和熊果酸的分離度大于1.5。如圖1所示。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，分別注入液相色譜儀中，按上述“2.3”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，以測(cè)定峰面積為為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得齊敦果酸回歸方程Y=62036.97X+2180.27，R=0.9997表明齊敦果酸進(jìn)樣量在0.20～2.46 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。得熊果酸回歸方程Y=146338.20X-1848.62，R=0.9999表明熊果酸進(jìn)樣量在0.49～6.15 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀中，按上述“2.3”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果，齊敦果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為0.17 %和0.09 %。表明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品（云南-祿豐）6份，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備并進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明齊敦果酸和熊果酸含量的RSD分別為1.57 %和1.63 %。表明本方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.6”項(xiàng)下同批的樣品在0、4、8、12、16、20 h分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果20 h內(nèi)齊敦果酸和熊果酸峰面積無明顯變化，RSD分別為1.33 %和1.31 %，表明被測(cè)樣品在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的樣品（云南-祿豐），齊敦果酸和熊果酸的含量分別為：2.08 mg·g^-1和5.58 mg·g^-1適量，約1 g，共6分，精密稱定，分別加入0.488 mg/mL齊敦果酸和0.912 mg/mL熊果酸的混合對(duì)照品溶液1.5、2.5和5.0 mL，揮干溶劑，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測(cè)定 分別取不同產(chǎn)地的姜味草，按供試品溶液制備方法制備，并進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取方式的選擇 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合李坤平等^[13]用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇作為溶劑超聲提取，對(duì)提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間三方面進(jìn)行優(yōu)化。①提取溶劑：對(duì)50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、無水乙醇和甲醇5種溶劑的提取效進(jìn)行比較，結(jié)果95%乙醇、無水乙醇和甲醇3種溶劑的提取率相近，50%乙醇和70%乙醇提取率較低;由于95%乙醇的毒性低且實(shí)驗(yàn)室較為常用，且無需提前對(duì)提取溶劑進(jìn)行配置。同時(shí)對(duì)齊敦果酸和熊果酸的測(cè)定無干擾，基線平穩(wěn)，故選用95%乙醇作提取溶劑;②提取方法：對(duì)加熱回流和超聲2種方法提取，提取率相近，考慮實(shí)驗(yàn)提取的快捷方便，故采用超聲提取作為提取方法;③提取時(shí)間：對(duì)供試品超聲時(shí)間20、30、45和60 min進(jìn)行考察，結(jié)果超聲20 min的提取率較低，30、45和60 min的提取率相近，故選擇30 min為提取時(shí)間。

3.2 檢測(cè)條件的選擇 齊敦果酸和熊果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，極性相似，較難分離。選用甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85∶15∶0.03∶0.06），柱溫箱溫度25℃，流速1 mL·min^-1時(shí)，齊敦果酸和熊果酸的保留時(shí)間較為接近，無法有效分離。繼而考察柱溫箱溫度15℃，流速0.8 mL·min^-1;柱溫箱溫度15℃，流速0.5 mL·min^-1時(shí)。結(jié)果兩種方法均能使齊敦果酸和熊果酸達(dá)到良好分離，分離度大于1.5。由于柱溫箱溫度15℃，流速0.8 mL·min^-1保留時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于柱溫箱溫度15℃，流速0.5 mL·min^-1。故選擇甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85∶15∶0.03∶0.06），柱溫箱溫度15℃，流速0.8 mL·min^-1為檢測(cè)條件。

由表2可知3個(gè)不同產(chǎn)地的姜味草中均含有齊敦果酸和熊果酸，但不同產(chǎn)地的姜味草中齊敦果酸和熊果酸含量的差別較大，其原因有待進(jìn)一步探討。

本研究建立了同時(shí)測(cè)定姜味草中齊敦果酸和熊果酸含量的方法，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且具有分離度好、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、供試品制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為姜味草質(zhì)量評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)提升提供了良好的方法和依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]蘭茂.滇南本草（第二卷）[M].昆明：云南人民出版社，1977：362.

[2]云南省食品藥品監(jiān)督管理局.云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn).2005年版.第六冊(cè)彝族藥（III）[S].昆明：云南科技出版社，2005：67-68.

[3]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：2046-2047.

[4]全國(guó)中草藥匯編編寫組.全國(guó)中草藥匯編（下冊(cè)）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：404

[5]李坤平，潘天玲，張鶯穎，等.姜味草水蒸汽蒸餾和超臨界CO2提取物的化學(xué)成分研究[J].貴州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，25（2）：165-168.

[6]李坤平，江嘉冕，陳潮珠，等.氣相色譜法測(cè)定姜味草揮發(fā)油中橙花醛與香葉醛[J].理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)），2011（7）：107-108.

[7]萬慶家，王文靜，張慶芝，等.云南不同產(chǎn)地姜味草中齊墩果酸的含量測(cè)定[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004（4）：10-13.

[8]李坤平，潘天玲，袁旭江，等.RP-HPLC測(cè)定姜味草中熊果酸和齊墩果酸的含量[J].中成藥，2009（6）：130-132.

[9]WANG X，YE X L ，LIU R，et al.Antioxidant activities of oleanolic acid in vitro： possible role of Nrf2 and MAP kinases[J]. Chem Biol Interact，2010，184（3）：328-337.

[10]ZIBEMA L， SAMEC D， MOCAN A，et al.Oleanolic acid alters multiple cell signaling pathways： Implication in cancer prevention and therapy[J]. Internation Journal of Molecular Sciences，2017，18（3）：643-655

[11]郭圓圓，朱德增.熊果酸改善胰島素抵抗的機(jī)制研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)藥，2019，41（11）：1732-1736.

[12]趙興奎，李振翮，王貴霞，等.熊果酸對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用研究[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2019，（32）：158-159.

[13]李坤平，潘天玲，賁永光，等.超聲波強(qiáng)化溶劑提取姜味草中熊果酸和齊墩果酸[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2009，29（3）：111-114.

（收稿日期：2021-04-25 編輯：陶希睿）